Т.М.ЖЕЛТИКОВА, д.б.н., А.М.ГЛУШАКОВА, к.б.н.,
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, Москва (директор ин-та – академик РАМН В.В.Зверев)
Грибы (дрожжи, микромицеты) оказывают многофакторное воздействие на организм человека. Они могут быть причиной токсических и аллергических реакций, а также способствовать формированию микозов. Все это в полной мере относится и к дрожжам рода Candida. Различные виды рода Candida, и в первую очередь Candida albicans, могут вызывать поражения кожного покрова, желудочно-кишечного и генитального трактов. Кандидозные вульвовагиниты являются одной из наиболее частых причин обращения женщин к гинекологу (Анкирская, 2009). По данным разных авторов, C. albicans выделяется у 73-90% больных кандидозным вульвовагинитом, C. glabrata – у 15-35%, а другие виды дрожжей, в том числе и C. parapsilosis – у 4-19% [2,3,5,10]. Очевидно, что успех лечения генитальных кандидозов зависит от выбора эффективного антимикотика.
Флуконазол – это международное непатентованное наименование (МНН) препарата, утвержденное Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Флуконазол – антимикотик для системного применения, и препараты на его основе особенно хорошо зарекомендовали себя при лечении микозов, вызванных дрожжами рода Candida. По биохимической структуре флуконазол является производным триазола и функционально работает как высокоактивный селективный ингибитор синтеза стеролов в клетках грибов. Как и другие препараты группы азолов, флуконазол угнетает образование эргостерола, основного компонента клеточной мембраны грибов. В низких концентрациях флуконазол нарушает биосинтез клеточной мембраны грибов, что приводит к развитию фунгистатического эффекта (задержке роста).
При достижении высоких концентраций вследствие перекисного окисления и других процессов в клетке происходит гибель гриба (фунгицидный эффект). В отличие от других азольных препаратов флуконазол обладает высокой специфичностью по отношению к зависимым от цитохрома Р450 ферментам гриба [6].
Молекула флуконазола была синтезирована и запатентована компанией Pfizer (США). Позднее, после окончания срока действия патента, на фармакологическом рынке появились дженерики, в состав которых также входит флуконазол. В связи с тем, что препараты-дженерики положено сравнивать с оригинальным препаратом по разным параметрам (биоэквивалентности, биодоступности, фармакокинетике и др.), целью нашего исследования было оценить in vitro фунгицидную активность различных антимикотиков на лабораторных культурах Candida albicans, C. glabrata и С. Рarapsilosis.
Материал и методы
Препараты. В работе были использованы оригинальный препарат, содержащий флуконазол – дифлюкан (Pfizer, США) и дженерики флуконазола: дифлазон (KRKA, Словения); флюкостат («Фармстандарт-Лексредства», Россия); микосист (Gedeon Richter, Венгрия); флуконазол (Hemofarm, Сербия); микомакс (Zentiva, Чехия). В опытах использовано не менее 5 упаковок препарата одного наименования, купленных в разных аптеках Москвы. Препараты исследовали в двух разведениях: 150 мг/мл и 2 мг/мл.
В качестве контроля использовали препарат дифлюкан для внутривенного введения в концентрации 2 мг/мл.
Культуры дрожжей и среды культивирования. Тест-штаммы Candida albicans (ВКПМ Y-3108), Candida glabrata (КБП 3049) и Candida. рarapsilosis (КБП 3050).
1. Среда Сабуро: 40 г – глюкозы, 10 г – пептона, 5 г – дрожжевого экстракта, 20 г – агара, 1000 мл – воды.
2. Пептонно-глюкозо-дрожжевой агар (ПГДА): 2% глюкоза, 1% пептон, 0,5% дрожжевой экстракт.
Дизайн эксперимента. Работа проводилась двойным слепым методом. В работе использовали луночно-диффузионный метод, который является модификацией диско-диффузионного метода [7-9]. В чашку Петри (d=90 мм) вносили 20 мл агаризованной среды. В центре делали лунку на 2/3 толщины слоя агара. После этого газоном засевали штаммы дрожжей (0,1 мл суспензии клеток в концентрации 106 кл/мл), а в лунку вносили препараты. Препараты в капсулах исследовались в суспензии в двух концентрациях: 150 мг/мл и 2 мг/мл. В лунку вносили 0,1 мл суспензии препаратов, приготовленных на физрастворе. Препарат дифлюкан для внутривенного введения (2 мг/мл) вносили в лунку в том же объеме. Каждый эксперимент проводили в трехкратной повторности. Инкубацию производили при 37°С в течение 24 ч, после чего проводили измерение зоны подавления роста дрожжевых грибов и фотографирование чашек.
Зоны ингибиции роста грибов измеряли в миллиметрах. Чем больше зона ингибиции роста гриба, тем выше фунгицидная активность препарата. Зоной ингибиции роста грибов считали зону полного подавления роста колоний. Однако, как и рекомендовано МУК 4.2.1890-04 [7], не обращали внимания на единичные и очень мелкие колонии грибов. Для контроля зон ингибиции роста проводили микроскопирование фрагментов агара.
Результаты и обсуждение. Все исследованные препараты флуконазола тормозили рост трех видов дрожжей как в концентрации 150 мг/мл (фото 1А-6А), так и в концентрации в 75 раз ниже (2 мг/мл) (фото 1Б-6Б). При этом зоны ингибиции роста дрожжей, образующиеся вследствие воздействия дифлюканом, были, как правило, достоверно больше как при концентрации 150 мг/мл, так и при концентрации 2 мг/мл, чем зоны ингибиции при воздействии другими препаратами, содержащими флуконазол (табл. 1-3; рис. 1-6, фото 1-6). В зоне отсутствия роста дрожжи были представлены редкими единичными клетками и небольшими редкими скоплениями, что допускается МУК 4.2.1890-04.
Во всех экспериментах с C. albicans зоны торможения роста достоверно больше при воздействии дифлюкана по сравнению с другими препаратами (табл.1; рис.1, 2; фото 1-6).
В экспериментах с C. parapsilosis, где концентрация препаратов была 150 мг/мл, зоны торможения роста дрожжей статистически достоверно больше при воздействии дифлюканом по сравнению с другими препаратами (табл. 2; рис. 4). В экспериментах с C. parapsilosis, где концентрация препаратов была 2 мг/мл, зоны ее торможения роста достоверно больше при воздействии дифлюканом по сравнению с флуконазолом, дифлазоном, микомаксом и флюкостатом. Тогда как в некоторых экспериментах, где концентрация препаратов была 2 мг/мл, зоны ингибиции роста C. parapsilosis дифлюканом (для внутривенного введения) и микосистом статистически достоверно не различались (табл. 2; рис. 3, фото).
В экспериментах с C. glabrata, где концентрация препаратов была высокой (150 мг/мл), зоны торможения роста дрожжей, как и в случае с C. albicans и C. parapsilosis, достоверно статистически значимо больше при воздействии дифлюканом по сравнению с другими препаратами (табл. 3; рис. 6). В экспериментах с C. glabrata, где концентрация препаратов была низкой (2 мг/мл), зоны ее торможения роста статистически достоверно больше при воздействии дифлюканом по сравнению с флуконазолом, микосистом, микомаксом и флюкостатом. Тогда как в некоторых экспериментах с этой же концентрацией препаратов зоны ингибиции роста C. parapsilosis дифлюканом (в капсулах) и дифлазоном различалась статистически недостоверно (табл. 3; рис. 5).
При сравнительном изучении фунгицидной активности дифлюкана на различные виды дрожжей наиболее чувствительными оказались C. albicans (ВКПМ Y-3108) и C. parapsilosis (КБП 3050) (рис. 7).
Проблема взаимозаменяемости оригинального препарата дженериками является одной из наиболее конфликтных и спорных. На российском фармакологическрм рынке на долю дженериков приходится от 78 до 95% [11]. Как правило, препараты дженерики должны быть эквивалентны оригинальному препарату по действующему веществу, фармакологическим показателям и терапевтической эффективности. Однако они могут отличаться по составу дополнительных веществ, способу синтеза действующего вещества и т.д. [11]. К сожалению, для практикующих врачей не всегда бывает доступна сравнительная информация о препаратах-дженериках.
При изучении in vitro только одного показателя – фунгицидной активности – препарата дифлюкан и его различных дженериков нами было показано, что этим свойством обладают все исследуемые препараты. Однако эта активность проявляется в различной степени. Сравнительный анализ зон ингибиции роста трех видов дрожжей рода Candida различными препаратами, содержащими в качестве МНН флуконазол, свидетельствует о том, что наибольшую статистически достоверную фунгицидную активность на всех трех модельных штаммах C. albicans (ВКПМ Y-3108), C. parapsilosis (КБП 3050), С. glabrata (КБП 3049) как при максимальной (150 мг/мл), так и минимальной (2 мг/мл) концентрации показал дифлюкан. Также очень важен тот факт, что дифлюкан тормозил рост штаммов не только C. albicans, но и других видов дрожжей – C. parapsilosis и C. glabrata. C. albicans и C. parapsilosis оказались достоверно более чувствительны к дифлюкану, чем устойчивый к различным антимикотикам C. glabrata [1,12]. Полученные нами данные свидетельствуют, что дифлюкан статистически достоверно более сильно подавляет рост C. glabrata, чем другие исследуемые препараты (рис. 6, 7). Похожие результаты по сравнительному изучению фунгицидной активности дифлюкана и некоторых его дженериков были получены и на других видах дрожжей рода Candida и, что важно, другими методами [4].
Таким образом, в результате проделанной работы мы пришли к следующим выводам:
1. При сравнительном изучении различных препаратов, содержащих флуконазол наибольшую статистически достоверную фунгицидную активность на всех трех модельных штаммах дрожжей, при максимальной (150 мг/мл) и минимальной (2 мг/мл) концентрации показал дифлюкан.
2. Фунгицидная активность капсулированной формы дифлюкана (2 мг/мл) и жидкой для внутривенного введения (2 мг/мл) статистически достоверно не отличалась как на C. albicans так и на C. parapsilosis.
3. Наиболее чувствительным к дифлюкану видом оказалась C. albicans (ВКПМ Y-3108) и C. parapsilosis (КБП 3050). Дифлюкан статистически достоверно более сильно подавляет рост C. glabrata, чем другие исследуемые препараты.
Литература
1. Анкирская А.С., Муравьева В.В., Миронова Т.Г., Королева Т.Е, Любасовская Л.А., Карапетян Т.Э., Байрамова Г.Р. Генитальный кандидоз в структуре оппортунистических инфекций влагалища. Принципы лабораторной диагностики и значение мониторинга чувствительности грибов к антимикотикам. Акушерство и гинекология, 2009, №5, с.31-37.
2. Анкирская А.С., Муравьева В.В., Фурсова С.А., Миронова Т.Г., Королева Т.Е. Мониторинг видового состава и чувствительности к антимикотикам дрожжеподобных грибов, выделенных из влагалища женщин репродуктивного возраста. // Клин.микробиол.антимикроб.химиотер., 2006, т.8, №1, с.87-95.
3. Бурова С.А. Особенности возникновения и комплексного лечения кандидозных вульвовагинитов. // Лечащий врач, 2003, №4, с.53-56.
4. Васильева Н.В., Выборнова И.В., Елинов Н.П. Чувствительность Candida species к флуконазолу и некоторым его дженерикам в испытаниях in vitro. Проблемы медицинской микологии, 2002, т.4, №2, с.43-44.
5. Кунгуров Н. В, Н. М. Герасимова, И. Ф. Вишневская Современные представления о лечении урогенитального кандидоза. Лечащий врач, 2004, №6, с.46-48.
6. Кунельская В.Я. Опыт применения микофлюкана (флуконазола) при лечении фарингомикоза. // Лечащий врач, 2005, №1, 67-69.
7. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Клин.микробиол.антимикроб.химиотерап.,2004, т.6, №4 с.306-359.
8. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. – М., «Медицина», 2004, 189 с.
9. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под. ред. Егорова Н.С. – М.: Изд-во МГУ, 1995, 224с.
10. Сметник В. П., Л. А. Марченко, Г. Е. Чернуха. Опыт применения микофлюкана (флуконазола) для лечения кандидозного вульвовагинита. Лечащий врач, 2004, №2, с.73-76.
11. Талибов О. Б. Дженерики и эквивалентность лекарственных препаратов. http://www.rusmg.ru.
12. Pfaller M. A., D. J. Diekema, M. G. Rinaldi, R. Barnes, B. Hu, A. V. Veselov, N. Tiraboschi, E. Nagy, D. L. Gibbs, and the Global Antifungal Surveillance Group.Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study: a 6.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing. J Clin Microbiol., 2005, 43(12), р.5848-5859.
