Т.К. ДЗАГУРОВА1, А.П. ИВАНОВ2, Н.А. КОРОТИНА1, А.Е. МАЛКИН2, А.А. СИНЮГИНА2, С.Е. СОЦКОВА1, А.А. ИШМУХАМЕТОВ2, Е.А. ТКАЧЕНКО1
1ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва; 2ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) -- вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. Случаи заболевания ГЛПС регистрируются в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8--10 тыс. больных в целом по стране.
Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, участившиеся случаи вспышек ГЛПС, ассоциированных с новыми, ранее не известными в России хантавирусами, свидетельствует о возрастающей медицинской и социальной значимости проблемы ГЛПС.
Открытию возбудителя ГЛПС предшествовал более чем 40-летний период поисков, успешно завершившийся в конце 70-х гг., когда впервые вирус-возбудитель ГЛПС был выделен в Южной Корее от полевой мыши Apodemus agrarius coreae [1].
Несколько лет после открытия возбудителя ГЛПС единственным лабораторным методом для выявления антигена вируса-возбудителя ГЛПС и антител к нему оставался непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА) с использованием препаратов криостатных срезов легочной ткани полевых мышей. Ограниченные возможности этого метода, а также трудности, связанные с использованием криостатных срезов легочной ткани диких грызунов (отлов диких животных, транспортировка и хранение легочных тканей, нестандартность антигенной активности препаратов, спонтанная инфицированность грызунов реовирусами, низкая производительность и др.), существенно тормозили изучение ГЛПС, а также применение специфической диагностики этой инфекции в широкой практике. Это в основном и явилось основанием для разработки и усовершенствования методов лабораторной диагностики ГЛПС, чему посвящена настоящая работа.
В процессе исследований было разработано и усовершенствовано применительно к хантавирусам 23 метода, включая иммунологические, вирусологические и молекулярно-генетические.
Иммунологические методы:
• непрямой МФА с использованием антигенсодержащих клеток VERO-Е6, инфицированных хантавирусами;
• реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) [2];
• реакция торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА) с использованием эритроцитарного диагностикума ГЛПС [2];
• два варианта радиоиммунологического анализа (РИА): родоспецифическая РИА-тест-система (прямой вариант) для определения антигенов хантавирусов и блок прямого РИА для определения антител к хантавирусам;
• 10 вариантов иммуноферментного анализа (ИФА): родоспецифическая ИФА-тест-система (прямой вариант) для определения антигенов хантавирусов; блок прямого ИФА для определения антител к хантавирусам; родоспецифическая ИФА-тест-система для определения антигенов и антител хантавирусов в варианте дот-блот-анализа; типоспецифическая ИФА-тест-система на основе моноклональных антител для определения вирусспецифического антигена хантавируса Puumala; типоспецифическая ИФА-тест-система для определения IgM и IgG антител к хантавирусу Hantaan; типоспецифическая ИФА-тест-система для определения IgM и IgG к хантавирусу Puumala; ИФА-тест-система для типирования хантавирусных антигенов с использованием биотинилированных моноклональных антител; дот-блот анализа, а также определение IgM и IgG антител с использованием рекомбинантных антигенов, полученных из Германии [3--8]; ИФА-тест-система «Ханта-ПУУ» для определения поверхностного белка хантавируса Puumala и универсальная ИФА-тест-система «Ханта-N» для определения нуклеокапсидного белка хантавирусов Puumala, Dobrava/Belgrad, Hantaan и Seoul [9].
Вирусологические методы:
• обнаружение и титрование вируса по индикации вирусспецифического антигена в клетках VERO-Е6 с использованием непрямого МФА;
• обнаружение и титрование вируса с использованием феномена фокусобразующих единиц (ФОЕ) [10, 11];
• реакция нейтрализации [10, 11].
Метод титрования вирусных частиц с использованием феномена ФОЕ использован в собственной модификации ранее описанного метода [12]. Была изменена концентрация метилцеллюлозы в покрытии (0,4% для вирусов Puumala и Tula); в качестве специфических антител использована сыворотка реконвалесцента ГЛПС-Пуумала с титром антител ≥ 32 000; в качестве выявляющих антител -- меченный пероксидазой белок А; в индикаторную систему добавляли краситель -- NiCl2, благодаря чему инфекционные фокусы «бляшки» приобретают более контрастный темный цвет.
Реакция нейтрализации с использованием феномена подавления числа ФОЕ применялась в собственной модификации, предусматривающей добавление комплемента при экспозиции вирус-сывороточной смеси, что стандартизует результаты нейтрализующей активности антител в сыворотках крови с различным сроком хранения. По нашим данным, такая модификация позволяет наиболее достоверно выявлять антигенные взаимоотношения между хантавирусами и, соответственно, обеспечивать надежную информацию к таксономической классификации хантавирусов.
Молекулярно-генетические методы:
• выделение хантавирусной РНК с использованием гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией;
• амплификация и секвенирование нуклеотидных последовательностей РНК-сегментов хантавирусного генома [13--15].
Из вышеперечисленных методов, апробированных нами в разноплановых по своему характеру и назначению исследованиях большого количества биологических материалов разного происхождения, был сформирован в конечном результате и широко используется в настоящее время комплекс методов, наиболее эффективных и значимых для исследований в области хантавирусологии, а также для диагностических целей. Если вирусологические и молекулярно-генетические методы в полном вышеуказанном составе вошли в этот комплекс, то среди иммунологических методов наибольшие преимущества получили четыре метода: непрямой МФА с использованием культурального антигена -- для выявления антител к хантавирусам у людей и животных; прямой метод ИФА -- для выявления хантавирусного антигена в органах мелких млекопитающих и секционных материалах погибших от ГЛПС людей; непрямой метод ИФА с использованием рекомбинантных антигенов хантавирусов -- для выявления IgM и IgG антител к хантавирусам -- для серодиагностики ГЛПС у больных людей, а также два метода ИФА с использованием моноклональных антител «Ханта-ПУУ» и «Ханта-N» для определения нуклеокапсидного и поверхностного белков хантавирусов при изготовлении инактивированных вакцинных препаратов против ГЛПС.
При сравнении эффективности применения разработанных нами иммунологических методов принимали во внимание не только их высокую чувствительность и специфичность, но и доступность для широкого применения в условиях практического здравоохранения. Кроме того, учитывали перспективность технологии промышленного изготовления диагностических препаратов. Так, в соответствии с этими критериями оценки эффективности было показано, что по сравнению с ранее применявшимся непрямым МФА (препараты криостатных срезов) возможность широкого практического применения иммуносорбентных методов ИФА и РИА для выявления вирусспецифического антигена у мелких млекопитающих в природных очагах ГЛПС имеет очевидные преимущества, обусловленные высокой производительностью при обследовании большого количества образцов суспензий органов, не нуждающихся в дополнительной очистке от грубых примесей, простотой и объективностью учета результатов опыта. Кроме того, в отличие от непрямого МФА иммуносорбентные методы и РНГА, обладая практически одинаковой чувствительностью и специфичностью, позволяют определять количественное содержание антигена в исследуемых материалах. Вместе с тем следует отметить, что при сравнении возможностей использования ИФА, РИА и РНГА для выявления хантавирусного антигена предпочтение отдано ИФА, поскольку применение РИА требует наличия дорогостоящего оборудования и высокого качества радиоактивных препаратов, а также специальной подготовки персонала, что ограничивает возможности использования этого метода в учреждениях практической сети здравоохранения. Что касается РНГА и РТНГА, то эффективность их широкого практического применения ниже по сравнению с ИФА и РИА, что связано главным образом с необходимостью предварительной обработки исследуемых материалов эритроцитами барана для удаления гетероагглютининов. При оценке эффективности применения двух вариантов непрямого МФА для выявления специфических хантавирусных антител в сыворотках крови больных и переболевших ГЛПС людей из разных регионов России было показано, что частота выявления серопозитивных лиц и среднегеометрические титры антител, выявляемых непрямым МФА с культуральным антигеном хантавируса (92%, титр Σ 8,3 log2), была значительно выше по сравнению с тем же методом, но с применением в качестве антигена препаратов криостатных срезов легочной ткани животных (72%, титр Σ 4,5 log2) [16].
Биотехнологические основы конструирования диагностикумов ГЛПС
Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции.
До разработки технологии изготовления культурального поливалентного диагностикума в том виде, в котором этот препарат был передан для промышленного освоения, пройден длительный и важный этап его конструирования. Этот этап был связан с усовершенствованием и оптимизацией процессов изготовления диагностического препарата, обусловленных как использованием в технологии новых данных, касающихся особенностей гуморального иммунитета при ГЛПС, антигенной вариабельности хантавирусов и их репродукции в культуре клеток, так и чисто практическими проблемами, возникавшими при широком применении диагностикума.
Первоначально культуральный диагностикум готовили на основе прототипного штамма Hantaan 76-118, полученного из Южной Кореи. Однако применение такого диагностикума в европейских очагах ГЛПС оказалось малоэффективным, особенно в ранние сроки болезни, поскольку циркулирующий в этих очагах вирус-возбудитель ГЛПС имеет, как выяснилось позже, антигенные различия с прототипным штаммом. В связи с этим для приготовления культуральных антигенов стали использовать выделенные нами в европейском и дальневосточном регионах России штаммы, относящиеся к хантавирусам Puumala и Hantaan. Вначале готовили и применяли моновалентные антигены (отдельно для каждого хантавируса), а затем комбинированный двухвалентный препарат, с тем чтобы при серологическом исследовании сывороток крови больных ГЛПС не пропустить гетерологичный для данного региона хантавирусный серотип. Диагностикум включал антигенные препараты, изготовленные по авторской технологии из 2 штаммов, представлявших штаммы хантавирусов Puumala и Hantaan, положительные и отрицательные контрольные сыворотки и ФИТЦ-конъюгат IgG против иммуноглобулинов человека. Поскольку антитела, вырабатываемые в ответ на заражение человека вирусами-возбудителями ГЛПС, относящимися к хантавирусам Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, при исследовании непрямым МФА перекрестно реагируют с минимальной разницей в титре, включение в состав диагностикума одного из этих вирусов для выявления антител ко всем остальным представлялось оправданным. Однако впоследствии было показано, что в остром периоде болезни титры антител в сыворотках крови больных ГЛПС, ассоциированной с хантавирусами Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, в 2--4 раза выше c гомологичным антигеном (в поздних сыворотках эта разница нивелируется). В этой связи для повышения чувствительности препарата при определении антител в ранние сроки болезни диагностикум ГЛПС был усовершенствован: в состав комбинированного двухвалентного антигена были дополнительно включены культуральные антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Seoul и Dobrava/Belgrad (рис. 1).
При разработке экспериментальных серий препарата были проведены научные исследования по изучению оптимальных условий размножения хантавирусных штаммов в культуре клаток VERO-Е6 и накопления вирусспецифического антигена; оптимальных условий приготовления антигенных препаратов; параметров полной инактивации инфекционной активности хантавирусов; оптимальных условий постановки непрямого МФА для выявления вирусспецифических флюоресцирующих антигенов хантавирусов и др.
Успешная апробация культурального диагностикума ГЛПС в широкой практике (серологически обследовано более 20 тыс. больных с подозрением на ГЛПС на 17 административных территориях России) и определение реальных потребностей в препарате практического здравоохранения явились обоснованием к технологической разработке промышленного производства этого диагностикума. Была разработана и утверждена соответствующая нормативно-техническая документация по изготовлению, контролю и применению культурального поливалентного диагностикума ГЛПС, проведены комиссионные испытания диагностикума в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также утверждена фармакопейная статья на диагностический препарат.
Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09140 от 01 ноября 2010 г. «подтверждает, что изделие медицинского назначения на набор реагентов «Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции» по ТУ 9388-017-01895045-2010 производства ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН разрешено к производству, продаже и применению на территории РФ».
В настоящее время диагностикум ГЛПС выпускается в виде набора реагентов, содержащего культуральный антигенный препарат и контрольные сыворотки. Антигенный препарат является основным действующим компонентом комплекта. Он представляют собой равномерно нанесенные на предметное стекло по 0,005 мл высушенные, инактивированные ультрафиолетовым облучением и фиксированные ацетоном суспензии клеток VERO-E6, содержащие специфические антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Puumala, Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, и клетки, не содержащие хантавирусных антигенов в соотношении 2:1:1:1:1. Визуально на стекле антиген определяется в виде серых пятен диаметром 2--З мм (по 12 или 21 капле на каждом стекле). Помимо антигенных препаратов, набор содержит контрольные иммунные сыворотки: анти-Hantaan, выявляющую антигены хантавирусов Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad; анти-Puumala, выявляющую антигены хантавируса Puumala; нормальную сыворотку человека, а также ФИТЦ-конъюгат против глобулинов человека.
К настоящему времени ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» произведено и реализовано более 200 коммерческих серий (по 500 комплектов в серии) поливалентного культурального диагностикума ГЛПС для непрямого МФА. Потребителями препарата являются медицинские учреждения практического здравоохранения в более чем 60 субъектах Российской Федерации, на территории которых регистрируется заболеваемость ГЛПС.
Несомненным достоинством диагностикума ГЛПС является то, что в антигенном поливалентном препарате имеется весь набор присущих хантавирусу антигенных детерминант, представленных в цитоплазме клеток в составе зрелых вирионов, а также компонентов сборки вирусных частиц: белка нуклеокапсида, гликозилированного белка наружной оболочки и его предшественников, вирусной РНК. Именно поэтому непрямой МФА остается стандартом при сравнении специфичности и чувствительности вновь создаваемых диагностических препаратов для серодиагностики ГЛПС.
Следует отметить, что культуральный диагностикум применяется и для исследования сывороток крови животных на присутствие хантавирусных антител. Для этого необходимо использовать ФИТЦ-конъюгат против глобулинов того вида животных, которому принадлежит исследуемая сыворотка.
Иммуноферментная тест-система «Хантагност» для определения антигенов хантавирусов
При разработке промышленной технологии изготовления иммуноферментной тест-системы «Хантагност» были проведены исследования по изучению формирования гуморального иммунитета у больных ГЛПС с целью выбора оптимальных сроков забора крови у реконвалесцентов. Кроме того, были оптимизированы условия конъюгации иммуноглоубина с пероксидазой хрена, условия постановки иммуноферментного анализа и режим хранения иммунохимических компонентов тест-системы. Определены чувствительность и специфичность тест-системы при выявлении культуральных (клетки VERO-E6) антигенов вирусов-возбудителей хантавирусных инфекций: Puumala, Hantaan, Seoul, Dobrava/Belgrad и Sin Nombre, а также показана высокая эффективность применения тест-системы при проведении широких эпизоотологических исследований (выявление хантавирусного антигена у диких грызунов) на территории России. Лабораторные серии тест-системы «Хантагност» успешно прошли испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и рекомендованы для внедрения в медицинскую практику.
Технологический цикл промышленного изготовления иммуноферментной тест-системы «Хантагност» (предусматривает выделение IgG из сыворотки крови реконвалесцентов после ГЛПС (не ранее 2 месяцев от начала заболевания) с титром антител к хантавирусу Puumala не менее 1 : 64 000 в непрямом МФА (рис. 2), а также приготовление «нормального» IgG (контроль специфичности) из сыворотки крови доноров, не содержащих антитела к хантавирусам. Пероксидазный конъюгат готовят путем конъюгирования пероксидазы хрена с анти-Puumala IgG. Контрольный антиген представляет собой инактивированный формалином лизат клеток VERO-E6, инфицированных хантавирусом Puumala. Специфические компоненты тест-системы «Хантагност» выпускаются в лиофильно высушенном виде за исключением пероксидазного конъюгата, который выпускается в жидком виде. Иммуноферментная тест-система «Хантагност» предназначена для определения антигенов всех известных хантавирусов-возбудителей ГЛПС в грубых суспензиях органов диких животных и обеспечивает быстрый скрининг сотен образцов.
Коммерческая тест-система представляет собой полный диагностический набор для прямого варианта ИФА (12-компонентный), состоящий из специфических компонентов: специфический и «нормальный» IgG для сенсибилизации иммунопанели, пероксидазный конъюгат, контрольный антиген -- и неспецифических компонентов: концентраты буферов, ферментный субстрат, иммунопанель. Один комплект рассчитан на обследование 47 образцов.
Регистрационное удостоверение №2010/09139 от 1.11.2010 «подтверждает, что изделие медицинского назначения на набор реагентов «Хантагност» -- тест-системы иммуноферментной для определения антигенов хантавирусов» по ТУ 9388-016-01895045-2010 производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова» разрешено к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации».
К настоящему времени ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П. Чумакова» произведено и реализовано более 70 коммерческих серий (по 250 комплектов в серии) иммуноферментной тест-системы «Хантагност». Потребителями препарата являются учреждения Роспотребнадзора в более чем 60 субъектах Российской Федерации, на территории которых регистрируется заболеваемость ГЛПС.
Заключение
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом занимает ведущее место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций в России. Заболевание протекает как острая инфекция с поражением почек, легких, центральной нервной и гормональной систем, наличием в ряде случаев тяжелых осложнений в остром периоде, приводящих к летальным исходам, и характеризуется длительным сроком восстановления до полного выздоровления. В этой связи проблема ГЛПС представляет серьезную медико-социальную проблему.
Открытие вируса -- одного из возбудителей этого заболевания в 1978 г. (Lee H.W. et al., 1978) стало этапным в изучении этой инфекции, а название вируса -- Хантаан стало родовым для многочисленных впоследствии открытых вирусов, как патогенных, так и не патогенных для человека.
Начало наших исследований по этой проблеме совпало с началом становления хантавирусологии. В первую очередь остро стоял вопрос методической составляющей исследований, поскольку в арсенале экспериментаторов поначалу имелся только метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием криостатных срезов легких инфицированных грызунов -- природных носителей вируса. Отсутствовала специфическая диагностика заболевания, соответственно, вопросы этиологии, ареала и нозоареала инфекции, о ее носителях в природе требовали своего решения.
В начале наших исследований наиболее важным был вопрос обеспечения исследований ГЛПС высокоэффективными и стандартными диагностическими препаратами. Это препараты для специфической лабораторной диагностики ГЛПС у больных людей, с одной стороны, и, с другой, для выявления возбудителей этой инфекции во внешней среде, поскольку источником заражения людей служат дикие грызуны.
В связи с этим были определены основные параметры конструирования иммуноглобулиновых диагностических препаратов, что позволило разработать технологическую схему их промышленного производства. Были разработаны и утверждены нормативно-технические документы по изготовлению, контролю и применению иммуноглобулиновой пероксидазной тест-системы для ИФА и культурального поливалентного диагностикума ГЛПС для непрямого МФА.
На базе ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова» осуществляется серийный промышленный выпуск культурального поливалентного диагностикума ГЛПС и иммуноферментной тест-системы «Хантагност». Следует отметить, что коммерческие препараты для специфической диагностики ГЛПС до внедрения в нашей стране нигде в мире не производились.
Экспериментальная разработка лабораторных методов применительно к хантавирусам и промышленное производство диагностических препаратов ГЛПС в значительной мере способствовало успеху, достигнутому в нашей стране и за рубежом в изучении ГЛПС, а также решению ряда задач практического здравоохранения, связанных с этой инфекцией.
Широкое применение разработанных нами методов специфической диагностики применительно к хантавирусам для обследования людей и мелких млекопитающих позволило значительно расширить наше представление о географическом распространении возбудителей ГЛПС и их носителей в природе. Отмечена тесная корреляция при обнаружении инфицированных хантавирусом мелких млекопитающих и серопозитивных к этому вирусу лиц среди населения административных территорий, где проводились параллельные исследования мелких млекопитающих и людей. В последние годы, благодаря серологическому обследованию людей с заболеваниями, сходными по некоторым симптомам с ГЛПС, в ряде районов России, в которых ранее не регистрировалась заболеваемость ГЛПС, были выявлены больные этой инфекцией.
Выводы
1. Впервые, применительно к хантавирусам, разработан комплекс лабораторных методов исследования материалов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих, позволивших существенно повысить эффективность специфической диагностики ГЛПС и получить новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусных лихорадок в нашей стране и за рубежом.
2. Результаты сравнительной оценки эффективности клинической и специфической лабораторной диагностики ГЛПС позволили установить истинные размеры заболеваемости, расширить представление о диапазоне клинических проявлений инфекции.
3. Получены экспериментальные данные, которые составили основу технологии изготовления иммунобиологических препаратов, предназначенных для специфической лабораторной диагностики ГЛПС.
4. В широкую практику здравоохранения внедрены два диагностических препарата: «Диагностикум ГЛПС культуральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции» и «Иммуноферментная тест-система «Хантагност» для определения антигенов хантавирусов». Применение первого диагностикума позволило существенно повысить эффективность специфической диагностики ГЛПС, что способствует, в свою очередь, своевременной госпитализации, а также выбору правильной тактики ведения и лечения больных. Практическое применение иммуноферментной тест-системы для определения инфицированности хантавирусами мелких млекопитающих открыло перспективу для оценки напряженности эпизоотического процесса у грызунов -- основного фактора, используемого для прогнозирования эпидемической ситуации и обусловливающего показания к проведению соответствующих противоэпидемических мероприятий в природных очагах инфекции.
Литература
1. Lee H.W, Lee PW, Johnson KM. Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever. J. Infect. Dis., 1978. 137: 298-308.
2. Гайдамович С.Я., Клисенко Г.А., Дзагурова Т.К. и др. Реакция непрямой гемагглютинации для индикации вируса ГЛПС и лабораторной диагностики заболеваний. Вопр. вирусол., 1984. 1: 82-85.
3. Ivanov AP, Tkachenko EA, Petrov VA et al. Enzyme immuno assay for the detection of virus specific Ig G and Ig M antibody in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. Arch Virol., 1988. 100: 1-7.
4. Иванов А.П., Деконенко А.Е., Шуткова Т.М., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. Поликлональная иммуноферментная система для определения антигенов хантавирусов: оценка специфичности с помощью моноклональных антител и полимеразной цепной реакции. Вопр. вирусол., 1996. 3: 110-112.
5. Иванов А.П., Дзагурова Т.К., Деконенко А.Е., Барановский П.М., Шервали В.И., Ткаченко Е.А. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов. Вопр. вирусол., 1996. 6: 263-265.
6. Tkachenko EA, Ivanov AP, Dzagurova TK, Donets MA, Rezapkin GV. Immunosorbent assay for diagnosis of HFRS. The Lancet, 1982, 8240, 257-258.
7. Ткаченко Е.А., Донец М.А., Дзагурова Т.К. и др. Усовершенствование лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Вопр. вирусол., 1981. 5: 618-621.
8. Tkachenko EA, Donets MA, Dzagurova TK. Serotypes of HFRS virus in East European and Far Eastern USSR. The Lancet, 1982. 10: 863.
9. Alexeyev OA, Elgh F, Ahlm C et al. Hantavirus antigen detection using human serum IgG M as the capturing antibody in an enzyme-linked immunosorbent assay. Am J Trop Med Hyg, 1996. 54, 4: 367-367.
10. Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Башкирцев В.Н. и др. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов-возбудителей ГЛПС в европейской части России. Медицинская вирусология, 2008. 25: 142-150.
11. Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Юничева Ю.В. и др. Обнаружение и клинико-этиологическая характеристика ГЛПС в субтропической зоне Краснодарского края. ЖМЭИ, 2008. 1: 12-16.
12. Lee PW, Gibbs CJ, Gajdusek C, Yanagihara R. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests. Journal of Clin. Microbiol., 1985. 22, 6: 940-944.
13. Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., Липская Г.Ю. и др. Генетическая дифференциация хантавирусов с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования. Вопр. вирусол., 1996. 1: 24-27.
14. Морозов В.Г., Дзагурова Т.К., Морзунов С.П. и др. Генетическая идентификация хантавирусов в крови больных ГЛПС. Эпидемиол. и инфекц. бол. 2004. 2: 43-47.
15. Dzagurova TK, Klempa B, Tkachenko EA et al. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus outbreak in the European part of Russia. J Clin Microbiol, 2009. 47, 12: 4029-4036.
16. Dzagurova TK, Klempa B, Tkachenko EA et al. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus outbreak in the European part of Russia. J Clin Microbiol., 2009. 47, 12: 4029-4036.
Источник: Ремедиум, № 10, 2015
