Разработка экспериментально – промышленной технологии производства вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Е.А.ТКАЧЕНКО¹, А.А.ИШМУХАМЕТОВ², Т.К.ДЗАГУРОВА¹, А.А.СИНЮГИНА², Н.А.КОРОТИНА¹, П.А.НАБАТНИКОВ¹, С.Е.СОЦКОВА¹, М.В.БАЛОВНЕВА¹, А.Е.МАЛКИН<sup>2

1</sup>ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова», Москва;

²ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова», Москва.

    

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. Случаи заболевания ГЛПС регистрируется в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8-10 тысяч больных, в целом по стране. 98% от общего числа случаев ГЛПС в России регистрируются в европейских регионах и 2% - в азиатских, главным образом, на Дальнем Востоке [1].

По данным Роспотребнадзора только за 15 лет XXI века было зарегистрировано более 108 тысяч случаев ГЛПС в 7 из 8 Федеральных округах, включая более 2,5 тысяч детей в возрасте до 14 лет. У более 400 больных ГЛПС тяжёлое клиническое течение болезни закончилось летальным исходом (Рис.1)

Результаты анализа структуры заболеваемости ГЛПС в России свидетельствуют об этиологической роли 5 хантавирусов. 97,7% всех случаев ГЛПС в России этиологически обусловлены вирусом Puumala (Рис. 2) и, только 2,3% - другими вирусами:  Hantaan, Amur и Seoul (все вместе -1,5%) и двумя генотипами (“Kurkino” и “Sochi”) вируса Dobrava/Belgrade (0,8%), что указывает на ведущую этиологическую роль вирусов серотипа Puumala в структуре заболеваемости ГЛПС в России.

Широкое распространение, высокие показатели заболеваемости людей, значительная частота тяжелых форм течения болезни, сопровождающихся длительным периодом пониженной трудоспособности, отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую социальную и медицинскую значимость проблемы ГЛПС в России. Социально-экономические потери усугубляются также тем, что из числа заболевших геморрагической лихорадкой до 85% составляют мужчины в возрасте от 20 до 40 лет, то есть, наиболее продуктивная часть населения.

Из всего комплекса мер неспецифической профилактики ГЛПС наиболее часто применяемой остается дератизация.  Дератизационные мероприятия обходятся  довольно дорого, а их применение обеспечивает лишь  кратковременное  снижение  численности грызунов на обработанных территориях и не решает проблемы ликвидации природного резервуара хантавируса.
 
Наиболее эффективным методом борьбы с ГЛПС является вакцинопрофилактика, что было продемонстрировано на протяжении последних 20 лет в Китае, Южной и Северной Корее. Однако вакцины против ГЛПС, производимые в этих странах на  основе вирусов Hantaan и Seoul, не обладают защитным действием  против  вируса Puumala – основного возбудителя ГЛПС у жителей Европейской части России, на которую приходится около 98% всей заболеваемости, регистрируемой в России. Трудности с разработкой культуральной вакцины против хантавируса Puumala довольно долго оставались не решёнными, в основном, из-за ограниченного выбора чувствительных к размножению этого вируса клеточных культур,  низкого уровня репродукции вируса, отсутствия цитопатогенного действия.

Следует отметить, что материальные затраты, связанные с лечением одного больного ГЛПС составляют ориентировочно 60-90 тысяч рублей. Соответственно, с учётом средней ежегодной заболеваемости в России (10 000 больных) затраты могут составить более 600 миллионов рублей.

При ориентировочной стоимости 1 дозы вакцины 200 рублей, затраты на проведение полной трёхкратной вакцинации одного человека составят, приблизительно 700 рублей, т.е. в 1000 раз меньше затрат на лечение.

Кроме того, ежегодные финансовые затраты на проведение дератизационных работ на эндемичных по ГЛПС административных территориях (а их только в европейской части России не менее 30) составляют от 15 до 20 миллионов рублей на каждую область.
    
Население эндемичных территорий, нуждающееся в вакцинопрофилактике этой инфекции составляет только в России около 20 миллионов человек, что обусловливает высокую коммерческую ценность вакцины и, соответственно значительную финансовую прибыль от реализации вакцины.

Создание вакцины против ГЛПС и ее широкое внедрение в  практику здравоохранения позволит в значительной  степени  уменьшить  тяжесть социально-экономических последствий, связанных с высокой заболеваемостью ГЛПС, сопровождающейся нередко летальным исходом.

В связи с вышеизложенным, одной из наиболее актуальных и приоритетных в настоящее время проблем является разработка технологии изготовления вакцинных препаратов против ГЛПС, эффективных для применения в России и отвечающих современным требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам, вводимым людям.
 
Биотехнологические основы конструирования культуральной, инактинированной вакцины против ГЛПС

При изготовлении вакцины ГЛПС в качестве субстрата для размножения хантавируса Puumala использовали линию перевиваемых клеток почек зеленой мартышки VERO, полученную из ВОЗ (WHO Vero cell bank from ECACC, Accession number 991042). Линия клеток VERO аттестована и рекомендована в качестве возможного субстрата для производства инактивированных вакцин (Протокол № 3  Заседания Ученого совета ГИСК им.Л.А,Тарасевича от 20 марта 2003 г. и Протокол №3 от 22 мая 2003 г. Комитета медицинских иммунобиологических препаратов). Использование этой линии клеток для производства инактивированной вакцины ГЛПС стало возможным в результате успешной адаптации штамма ТКД/Уфа-97 вируса Puumala, выделенного из крови больного ГЛПС в Башкирии, к размножению в клетках VERO.

Адоптированный в процессе 20-ти кратного пассирования в культуре клеток VERO хантавирусный штамм не мог, однако, непосредственно использоваться в качестве посевного вируса, поскольку ранее его культивировали на перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (линия клеток  VERO-E6). Несмотря на то, что по паспорту, культура клеток   VERO-E6 не обладала туморогенностью и не содержала посторонних агентов, тем не менее, полностью нельзя было исключить возможность контаминации штамма нежелательными компонентами,  в том числе возможными онкогенами. В связи с этим была проведена очистка штамма от посторонней ДНК путём обработки ДНКазой и последующей очистки зональным ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. В результате получена соответствующая фракция вируса, которая после фильтрования через фильтр 0,22 мкм была использована для наработки штаммового запаса вируса, который был  охарактеризован  по всем требованиям, предъявляемым к аналогичным препаратам, включая тесты на специфическую идентичность, стерильность, отсутствие микоплазм, клеточной ДНК и т.д.  (Сборник инструкций по общим методам контроля МИБП, утвержденный приказом Госкомсанэпиднадзора РФ от 31.10.96).

Перечисленные контроли осуществлены дважды: - на уровне производственных штаммов и собственно посевных вирусов. Аттестованный посевной штамм ТКД/Уфа-97 (Табл. 1) был использован для накопления вируссодержащего материала, послужившего основой для изготовления экспериментальных серий вакцинного препарата.

Таким образом, проведенная нами очистка хантавирусного штамма, адаптация его к перевиваемой культуре клеток VERO, использование данной культуры в качестве культуры-продуцента, аттестация посевного штамма в соответствии с требованиями регламентирующих документов позволили разработать технологию изготовления лабораторных серий инактивированной вакцины против ГЛПС на основе вируса Puumala.
 
В результате изучения кинетики инактивации было показано, что в очищенном вируссодержащем субстрате, обработанном 0,05 % раствором формалина, инфекционная активность вирусов не определялась по истечении экспозиции в течение 30 мин. При обработке  0,025 % и 0,0125% растворами формалина время инактивации вируса увеличивалось до 6  и 48 часов, соответственно (Рис. 3). Как и в случае с выбором температурного режима, руководствуясь желанием избежать повреждений структуры белков и сохранения максимальной антигенной активности инактивированного продукта, было принято решение об использовании в дальнейшем 0,025 %  раствора формалина. С учетом запаса надежности, предложенная схема инактивирования инфекционной активности  хантавируса включает экспозицию вируссодержащего субстрата при температуре 6±2°С в присутствии 0,025 %  раствора формалина в течение 30 суток.     

Концентрирование вируса проводили методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке. На первом этапе очистки балластные компоненты удаляли с помощью осветляющей  фильтрации, используя фильтр Poly Pro XL (CUNO) с размерами пор и площади поверхности 0.6 мкм и 0,14 м2, соответственно. Второй этап - гель-фильтрация с использованием Sepharose 6 FF и хроматографа AKTA purifier (GE Healthcare). Для оптимизации процессов, осуществляемых на каждом из этих этапов, были изучены и определены параметры взаимодействия вируса с разными пористыми сорбентами. В результате проведенных исследований отобрана гельфильтрационная схема очистки вируса, приводящая к получению высокоактивных препаратов, удовлетворяющих требованиям к чистоте конечного продукта (Рисунки 4,5,6).

Из инактивированной формалином, сконцентрированной и очищенной антигенсодержащей  культуральной жидкости после стерилизующей фильтрации через фильтр Миллипор с размером пор 0,22 мкм получали вакцинный препарат.

                                                                                                                                                                                                       - 
Следует отметить, что практически на всех этапах изготовления вакцины, начиная от получения производственного штамма вируса и кончая готовой формой вакцины, предусмотрены   физико-химические и молекулярно-биологические тесты, а также контроли на животных и в культуре клеток (Табл. 2). Эта система надёжно обеспечивает безопасность применения новой вакцины, высокий уровень и стабильность её иммунологической активности. Отсутствие туморогенности обеспечено за счет резкого снижения на стадии гельфильтрации содержания клеточной ДНК (менее, чем 10 нг в одной вакцинной дозе). Таким образом, вакцинный препарат представляет собой инактивированный вирус Puumala.

На завершающей стадии приготовления вакцины ГЛПС определяли антигенную активность и рассчитывали рабочую дозу (РД) вакцинного препарата. В соответствии с предварительно установленным соотношением зависимости между количеством содержащегося в вакцине специфического антигена и её иммуногенной активностью минимальная иммунизирующая доза (МИД), то есть максимальное разведение исходного препарата, обеспечивающее продукцию вируснейтрализующих антител у 50% животных, соответствовало 8 антигенным единицам (АЕ). Разведение исходного препарата, содержащего 4 МИД или 32 АЕ, принимают за 1 РД вакцины.
      
Специфическую активность инактиврованной вакцины характеризовали по иммуногенности на мышах Balb/c. то есть, по способности препарата индуцировать у животных продукцию специфических хантавирусных антител.     Для оценки иммуногенности готовую адсорбированную вакцину вводили не менее, чем 6 мышам линии Balb/c  9-10 недельного возраста, весом 18-20 г.  в объёме 0,5 мл  подкожно 3-х кратно с 2-х недельным интервалом, используя для одной иммунизации I РД готовой вакцины. В качестве контрольных использовали мышей Balb/c, которым в те же сроки вводили адсорбент гидроокись алюминия.  Через 2 недели после последней инъекции у животных брали из орбитальной вены кровь и готовили из неё сыворотку. В полученных сыворотках крови определяли титр вируснейтрализующих антител к штамму ТКД/Уфа-97 хантавируса Puumala, используя  метод ФОЕ.

Все 3 лабораторные серии вакцины индуцировали анти-вирусные антитела у 100 процентов животных и в довольно высоких титрах (Табл. 3).

Таким образом, из приведенных выше данных следует, что разработанные препараты вакцины ГЛПС обладают выраженной иммуногенной активностью. Остаётся невыясненным, какова же реальная доза вакцины, способная защитить человека от инфекции. По литературным данным,  производимая в Китае вакцина против хантавируса Hantaan, вызывающая при иммунизации кроликов продукцию специфических вируснейтрализующих антител с титрами 1:10, способна оказать 100% протективный эффект при 3-х кратной вакцинации людей.

При введении препарата готовой адсорбированной вакцины мышам линии Balb/c  не наблюдалось кожных уплотнений в местах введения, гиперемии кожи или абсцессов. Предполагается, что побочное действие инактивированной вакцины ГЛПС будет аналогичным,  как и у близких препаратов, типа инактивированной полиомиелитной вакцины, инактивированной вакцины клещевого энцефалита и др. Нет оснований ожидать каких-либо серьёзных осложнений при вакцинации этим препаратом ввиду его высокой степени очистки.

Таким образом, проведенная нами адаптация штамма хантавируса Puumala к перевиваемой культуре клеток VERO и возможность использования данной культуры в качестве культуры-продуцента, аттестация вакцинного штамма ПУУ-ТКД/VERO в соответствии с международными требованиями, оптимизация условий концентрирования, очистки и инактивирования вируса, а также разработка методов контроля позволили создать на основе отечественного штамма вируса Puumala культуральную, инактивированную, концентрированную, очищенную, сорбированную   вакцину против ГЛПС.

Лабораторные серии вакцины успешно прошли тестирование с использованием регламентированных методов контроля медицинских иммунологических препаратов, вводимых людям (Табл. 4).

Обсуждение и выводы

Начало исследований по созданию хантавирусных вакцин приходится на середину 80-х годов, когда методы выделения и культивирования хантавирусов в лабораторных условиях стали доступными для широкого применения. Пионерами этих исследований были учёные из Японии, Китая, Северной и Южной Кореи, при этом в итоге, китайским и корейским учёным удалось успешно решить проблему вакцинопрофилактики ГЛПС в своих странах.

Приняв за основу технологию изготовления коммерческой вакцины против японского энцефалита, разработанную в 1976 году [4], авторами были приготовлены и испытаны 9 модификаций инактивированной мозговой вакцины против ГЛПС [5-11].

Культуральные хантавирусные вакцины были созданы только в Китае, при этом, в качестве субстрата для четырёх модификаций авторы использовали клетки почек золотистого хомяка [6,10,12] и почек монгольской песчанки [11,13,15] и для одной модификации - клетки куриных эмбрионов [14].  
 
Помимо инактивированных цельновирионных вакцин, к настоящему времени авторами (главным образом, в США) предприняты попытки создания рекомбинантных генно-инженерных хантавирусных вакцин. К ним относятся четыре вакцины на основе субклонированных кДНК, представляющих M- и S-сегменты РНК вируса Hantaan, встроенных в геном вируса осповакцины [16, 17] и в геном вируса Sindbis [18]; а также вирусов Seoul и Sin Nombre, встроенных в геном цитомегаловируса [19,20]. На лабораторных животных была показана иммуногенная и протективная активность рекомбинантных вакцинных препаратов в отношении соответствующих хантавирусов. Вместе с тем, при испытании таких препаратов (на основе встроенных в геном  вируса осповакцины сегментов генома Hantaan) на волонтерах было установлено, что среди ранее привитых против оспы, процент выявления вируснейтрализующих антител к вирусу Hantaan составлял лишь 26%, в то время как у не привитых – 72% [21]. Очевидно, низкие показатели иммунного ответа к хантавирусу  – следствие некорректного выбора носителя, но вовсе не отсутствие перспективы у самой идеи создания рекомбинантной вакцины.
 
В последнее десятилетие интенсивно разрабатывается новый класс противовирусных вакцин – так называемых ДНК-вакцин [22,23]. Их отличают полноформатный защитный эффект (одновременно "гуморальный" и клеточный), а также безопасное производство (когда речь идет о хантавирусах), снятие проблемы транспортировки готовых препаратов, связанной с необходимостью организации так называемой "холодовой цепочки", - и др. В общем виде эти вакцины представляют собой гены протективных белков, способные контролировать в клетках вакцинируемого организма синтез протективных белков, обусловливающих формирование защитного иммунного ответа. Применительно к хантавирусам  подобная ДНК-вакцина (на основе вируса Seoul) разработана  в США [24,25].

Таким образом, за последнее время отмечен явный прогресс как в изучении хантавирусов, так и разработке вакцинопрофилактики хантавирусных инфекций. К настоящему времени лицензированы 6 хантавирусных вакцин, включая 3 культуральных и одну мозговую в Китае, и по одной мозговой вакцине в КНДР и Южной Корее. К сожалению, ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России, поскольку все они производятся на основе хантавирусов Hantaan или Сеул и не обладают защитным действием  против вируса Puumala – основного возбудителя ГЛПС на территории Европейской части России.

В России только в ФГБНУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова и ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова ведутся исследования по разработке отечественных вакцинных препаратов против ГЛПС. Ещё в середине 90-х годов совместно с южно-корейскими исследователями  была разработана технология изготовления  бивалентной комбинированной (Puumala - Hantaan вирусы) вакцины против ГЛПС на основе субстрата  мозговой ткани сирийских хомяков [26]. Лабораторные испытания этой вакцины на животных выявили специфический иммунный ответ к хантавирусам Puumala и Hantaan, при этом, продукция вируснейтрализующих антител (основной показатель протективной активности) к обоим вирусам в ответ на введение бивалентной вакцины была более высокой, чем в ответ на введение моновалентных вакцин.  Однако, мозговые вакцины по сравнению с культуральными не могут удовлетворять в полной мере современным требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам, вводимым людям.  
 
Помимо мозговой вакцины сотрудники ИПВЭ им. М.П. Чумакова участвовали в конструировании аэрозольной ДНК-вакцины против ГЛПС [27,28]. Однако, в результате аэрозольной и парентеральной иммунизации лабораторных животных была показана низкая иммуногенность препарата, не обеспечивающего требуемого иммунного ответа, даже если он использовался в предельно высоких концентрациях.

На сегодняшний день в качестве наиболее перспективного вакцинного препарата для применения в европейских регионах России и других европейских стран может рассматриваться культуральная вакцина, приготовленная на основе вируса Puumala.

В процессе работы над созданием оптимальной биологической схемы изготовления вакцинных препаратов были решены ключевые задачи:

1. Адаптация штамма ТКД/Уфа-97 хантавируса Puumala к размножению в культуре перевиваемых клеток почек зеленой мартышки VERO.
2. Аттестация вакцинного штамма ПУУ-ТКД/VERO в соответствии с международными требованиями.
3. Установлено преимущество роллерного способа культивирования по сравнению со стационарным способом. При этом  максимальные показатели выхода вируса в культуральную жидкость при роллерном культивировании были в 10 раз выше, чем при стационарном и составляли 6,2-6,5 lg ФОЕ/мл  для штамма ПУУ-ТКД/VERO.
4. Показана выраженная зависимость  сроков максимального выхода вируса в культуральную жидкость от множественности заражения клеток, что позволило определить оптимальные сроки и кратность сбора урожаев вируса.
5. В результате изучения динамики инактивирования хантавирусов при разных температурных режимах и при обработке разными концентрациями формалина была выбрана наиболее оптимальная схема, включающая инактивирование вируса при температуре 6±2 °С в присутствии 0,025% раствора формалина в течение 30 суток.
6. Для определения остаточного вируса была разработана методика, включающая проведение 5 серийных пассажей исследуемого субстрата на культуре клеток VERO-E6 с исследованием лизата клеток и культуральной жидкости после каждого пассажа на присутствие вируса с помощью методов иммунофлюоресценции и фокусообразования.
7. Разработаны оптимальные условия концентрирования вирусов методом  ультрафильтрации в тангенциальном потоке и очистки первичного концентрата методом гель-фильтрации.
8. Для определения специфической активности вакцинных препаратов на технологических этапах их производства разработаны методы определения хантавирусных антигенов, ассоциированных с белками N, G1/G2.
9. Для оценки иммуногенной активности  вакцинных препаратов разработана схема иммунизации мышей линии Balb/c с последующей детекцией вируснейтрализующих антител.


Литература

1. Е.А.Ткаченко, А.Д.Бернштейн, Т.К.Дзагурова, В.Г.Морозов, Р.А.Слонова, Л.И.Иванов, Д.В.Транквилевский , Д.Крюгер.  Актуальные проблемы современного этапа изучения геморрагической лихорадки с почечным синдромом в России. ЖМЭИ, 2013, №1, стр. 51-58.
2. Klempa B., Tkachenko E., Dzagurova T., Yunicheva Yu., Morozov V., Okulova N., G.Slyusareva, Smirnov A., Kruger D. Hemorrhagic fever with renal syndrome caused by two distinct lineages of Dobrava hantavirus emerging in Russia. Emerging Infectious Diseases Journal. 2008, v.14, no.4, p. 617-625.
3. Nur Hardy Abu Daud, Hiroki Kariva, Evgeniy Tkachenko, Tamara Dzagurova, Olga Medvedkina, Petr Tkachenko,  et al. Genetic and antigenic analyses of a Puumala virus isolate as a potential vaccine strain. Japanese Journal of Veterinary Research. 2008, 56 (3), 151-165.
4. Oya A. Japanese encephalitis vaccine: the vaccination. International Medical Foundation of Japan 1976; 69-72.
5. Lee H., Ahn C., Song J. Et al. Field trial of an inactivated vaccine against HFRS in humans. Arch Virol (Suppl 1),1990, p.35-47.  
6. Cho H., Howard C. Antibody responses in humans to an inactivated hantavirus vaccine (Hantavax). Vaccine, 1999, 17, p.2569-2575.
7. Lee H.W., Chu Y.K., Woo Y.D., An C.N., Kim H., Tkachenko E., Gligic A. Vaccines against HFRS. In book “Emergence and Control of Rodent-Borne Viral Diseases”. France, Elsevier. 1999, p.147-156.
8. Kim R., Ryu C., Kim G. et al. Antibody formation and epidemiological preventive effect after vaccination with the inactivated vaccine against HFRS. Abstracts of 2nd Symposium on Arboviruses in the Mediterranean countries, 1989, Dubrovnik, p.58
9. Ким Р., Ру Ч., Ким Г.М. с соавт. Специфическая профилактика ГЛПС  в КНДР. Тезисы международного симпозиума по ГЛПС. Ленинград, СССР, 1991, c. 16-17
10. Sun Z., YU Y., Wang W., Wang D. Studies on the purified inactivated epidemic hemorrhagic fever vaccine. Clinical trial of type 1 EHF vaccine in volunteers. Abstracts of 2nd  Intern. Conference on HFRS, 1992, Beijing, China, p.109-110.
11. Chen H., Luo Z., Zhang J. Study on epidemiological efficacy and immunologic strategy of vaccines against HFRS. Chines Public Health, 1999, 15, p.561-568.
12. Sun Z., Wang W., Sheng Y. Studies on the purified inactivated epidemic hemorrhagic fever vaccine. Clinical trial of type 2 EHF vaccine in volunteers. Abstracts of 2nd  Intern. Conference on HFRS, 1992, Beijing, China, p.111-112.
13. Zhu Z., Yu Y. The investigation on the use of the inactivated EHF tissue culture vaccine in humans. Abstracts of 2nd  Intern. Conference on HFRS, 1992, Beijing, China, p.105.
14. Dong G., An Q., Zhihue Y., Wenxue L. Efficacy of a chicken embryo tissue culture inactivated HFRS vaccine used in a clinical trial. Abstracts of 5th Intern Confer on HFRS, HPS and Hantaviruses, 2001, France, p.239.
15. Yongxin Y., Zhiyong Z., Zhihui Y., Guanmu D. Inactivated cell-culture Hantavirus vaccine developed in China. In book “Emergence and Control of Rodent-Borne Viral Diseases”. France, Elsevier. 1999, p.157-161.
16. Schmaljohn C., Hasty S., Dalrymple J. Preparation of candidate vaccinia-vectored vaccines for HFRS. Vaccine, 1992, 10:10-13.
17. Chu Y., Jennings., Schmaljohn C. A Vaccinia virus-vectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul viruses but not Puumala virus. J of Virol, 1995, p.6417-6423.
18. Kamrud K., Nelle T., VanderZanden L., Anderson K., Schmaljohn C.Evaluation of naked DNA and alphavirus-based hantavirus vaccines. Abstracts of 4th Intern. Confer. on HFRS and Hantaviruses. Atlanta, USA, 1998, P.95.
19. Hooper J., Kamrud K., Elgh F., Custer D., Schmaljohn C. - Development and testing of DNA vaccines against hantaviruses. Am J of Trop Med and Hyg. Supplement. 1998, 59:3, P.124-125.
20. Bharadwaj M., Lyons C., Wortman B., Hjelle B. Genetic immunization with Sin Nombre virus cDNAs induces T cell  proliferative  responses and antibodies in Balb/C mice. Am J of Trop Med and Hyg. Supplement. 1998, 59:3, P.124.
21. McClain D., Summers P., Harrison A., Schmaljohn A., Schmaljohn C. Clinical evaluation of a vaccinia-vectored Hantaan virus vaccine. J Med Virology, 2000, 60, p.77-85.
22. Giese M. DNA-antiviral Vaccines: New developments and Approaches – a review. Virus Genes 1998;  17(3): 219-32
23. Lai W.C., Bennett M. DNA vaccines. Crit.Rev.Immunol 1998; 18 (5): 449-84
  24. Hooper J., Kamrud K., Elgh F., Custer D.,  Schmaljohn C. DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and protects Seoul virus infection. Virology, 1999, 255, 269-278.
25. Kamrud K., Hooper J., Elgh F., Schmaljohn C. Comparison of the protective efficacy of naked DNA, DNA-based Sindbis replicon, and packaged Sindbis replicon vectors expressing hantavirus structural genes in hamsters. Virology, 1999, 263, p.209-219.
26. Lee H.W., Chu Y.K., Woo Y.D., An C.N., Kim H., Tkachenko E., Gligic A. Vaccines against HFRS. In book “Emergence and Control of Rodent-Borne Viral Diseases”. France, Elsevier. 1999, p.147-156
27. Filatov F., Schmaljohn С., Hooper J., Tkachenko E. et al. Prospects for aerosol delivery of DNA vaccines against hantaviruses. Abstr. of 5th Intern. Conference on HFRS, HPS, and hantaviruses. France, Veyrier-du-Lac, 2001, 238.
28. Filatov F., Tkachenko E., Schmaljohn C., Hooper J.,  et al. Immune response to aerosol delivery of the cloned hantavirus genes. Abstract book. VII Intern. Conf. on HFRS, HPS and Hantaviruses. Buenos Aires, Argentina. 2007, 187.