Л.Л. ШАМАЛЬ, Т.А. ЯРУШОК, И.Е. ШОХИН, Г.В. РАМЕНСКАЯ, Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
В работе проведено определение равновесной биофармацевтической растворимости субстанций лекарственных средств, применяемых при лечении онкологических заболеваний методом встряхивания в термостатируемом шейкере при температуре 37 ºC при скорости вращения 1 400 об/мин в течение 24 ч.
Введение
Биофармацевтическая классификационная система была разработана для того, чтобы использовать научные знания для оценки биофармацевтических свойств субстанций (активных фармацевтических ингредиентов) -- водной растворимости и кишечной проницаемости [1]. Данные о растворимости и проницаемости необходимы технологам и разработчикам для улучшения высвобождения лекарственного вещества из лекарственной формы и подбора оптимального состава вспомогательных веществ [2]. Основная цель биофармацевтической классификационной системы -- создание регуляторного орудия, которое позволяет упростить некоторые испытания биоэквивалентности тестами in vitro [3]. В настоящее время согласно Руководству по экспертизе лекарственных средств (том I) возможно предоставление данных о сравнительной кинетике растворения дженерика и препарата сравнения без исследований биоэквивалентности для дополнительных дозировок при соблюдении определенных условий [4].
Наиболее полное представление о биофармацевтических свойствах активных фармацевтических ингредиентов сокращает время и снижает затраты при разработке лекарственной формы и выводе лекарственного препарата на рынок, не снижая его качества, что особенно важно для дорогостоящих препаратов, используемых в лечении онкологических заболеваний, ВИЧ и т. д.
Растворимость лекарственного вещества, измеренная в воде, не всегда отражает растворимость в желудочно-кишечном тракте. Использование водной растворимости для предсказывания абсорбции лекарственного средства для перорального применения может привести к выраженным отклонениям в оценке биодоступности, особенно для плохо растворимых и липофильных лекарственных веществ. Механизмы, ответственные за усиление растворимости в просвете желудочно-кишечного тракта, обсуждаются [5].
Для определения растворимости ЛС равновесная растворимость оценивается в условиях, соответствующих физиологическим; другими словами, это значение должно быть определено при температуре 37 ± 1˚С в различных средах со значениями pH в диапазоне 1--7,5. Класс растворимости получается путем расчета объема раствора, необходимого для растворения максимальной дозировки во всем диапазоне pH [1]. Цель настоящего исследования -- изучить биофармацевтическую растворимость лекарственных веществ, применяемых для лечения онкологических заболеваний -- темозоломида, иматиниба и капецитабина, входящих в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП) [6]. Кроме того, данные препараты входят в список стратегически значимых лекарств [7]. Государство ставит задачу, чтобы к 2015 г. все эти ЛС производились только на территории страны.
Материалы и методы
Объекты исследования
• темозоломид, субстанция-порошок (страна-производитель -- Россия, содержание темозоломида 99,86%);
• иматиниба мезилат, субстанция-порошок (страна-производитель -- Россия, содержание иматиниба мезилата 98,97%);
• капецитабин (страна-производитель -- Россия, содержание капецитабина 99,75%).
1. Темозоломид (3,4-Дигидро-3-метил-4-оксоимидазо[5,1-d]-1,2,3,5-тетразин-8-карбоксамид)
Белый кристаллический порошок, малорастворимый в воде и растворах кислот (около 3 мг/мл).
Фармакологическое действие: противоопухолевое, алкилирующее, иммунодепрессивное. В системном кровотоке при физиологических значениях pH подвергается быстрому химическому превращению в цитотоксичный монометилтриазеноимидазолкарбоксамид (МТИК). Цитотоксическое действие МТИК обусловлено алкилированием гуанина в положении О6 и N7 (дополнительно) с последующим запуском механизма аберрантного восстановления метилового остатка. Нарушает структуру и синтез ДНК, клеточный цикл.
2. Иматиниб (4-[(4-Метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамид (и в виде мезилата))
Иматиниба мезилат -- белый или почти белый с коричневатым или желтоватым оттенком кристаллический порошок. Растворим в водных буферных растворах при pH ≤ 5,5; растворим очень незначительно или нерастворим в нейтральных/щелочных водных растворах. Растворимость в неводных растворителях варьирует от неограниченной до очень незначительной в диметилсульфоксиде, метаноле и этаноле; нерастворим в n-октаноле, ацетоне и ацетонитриле. Молекулярная масса 589,7.
Фармакологическое действие: противоопухолевое средство, ингибитор протеинтирозинкиназы (Bcr-Abl тирозинкиназы) -- аномального фермента, продуцируемого филадельфийской хромосомой при хроническом миелолейкозе.
3. Капецитабин (5'-Дезокси-5-фтор-N-[(пентилокси)карбонил]цитидин)
Белый или почти белый кристаллический порошок с растворимостью в воде 26 мг/мл при 20 °С.
Фармакологическое действие: противоопухолевое. Активируется в ткани опухоли и оказывает на нее селективное цитотоксическое действие; in vitro капецитабин цитотоксическим действием не обладает. В организме превращается в 5-фторурацил (5-ФУ), который подвергается дальнейшему метаболизму. Образование 5-ФУ из капецитабина происходит в ткани опухоли (под действием опухолевого ангиогенного фактора тимидинфосфорилазы), что сводит к минимуму системное воздействие 5-ФУ на здоровые ткани организма. Как здоровые, так и опухолевые клетки метаболизируют 5-ФУ в цитотоксически активные метаболиты: 5-фтор-2'-дезоксиуридина монофосфат (ФдУМФ) и 5-фторуридина трифосфат (ФУТФ).
Приготовление стандартных растворов
Стандартный раствор темозоломида
Около 25 мг (точная навеска) стандартного образца темозоломида помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли приблизительно 35 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8), помещали колбу в ультразвуковую ванну на 5 минут. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем тем же растворителем до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 1 темозоломида равна 0,5 мг/мл). 1 мл раствора 1 помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 40 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты pH 1,2 или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8), перемешивали, доводили объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 2 темозоломида равна 0,01 мг/мл).
Темозоломид в буферном растворе при значении pH 6,8 частично гидролизуется с образованием активного цитотоксического триазена MTIC, что проявляется внешне пожелтением раствора спустя 4 ч.
Стандартный раствор иматиниба мезилата
Около 50 мг (точная навеска) стандартного образца иматиниба мезилата вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 25 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8), доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 1 иматиниба мезилата 0,5 мг/мл). 1 мл полученного раствора вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 2 иматиниба мезилата 0,01 мг/мл).
Приготовление стандартного раствора капецитабина
Около 20 мг (точная навеска) стандартного образца капецитабина помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяли в 40 мл спирта 96%, доводили объем раствора 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8) до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 1 капецитабина 0,1 мг/мл). 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 8 мл растворителя с соответствующим pH, перемешивали. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем до метки тем же растворителем, перемешивали (концентрация полученного раствора 2 капецитабина 0,01 мг/мл).
Методика испытания
Определение равновесной растворимости субстанции проводили на приборе -- термошейкере в течение 24 ч при 1 400 об/мин. и 37 ºС в трех средах: буферных растворах с pH 4,5; 6,8 и 0,1 M HCl pH 1,2. Испытание проводили в трех повторностях для каждой из сред растворения. В микропробирку Eppendorf вместимостью 1,5 мл со средой растворения (объем среды растворения 1 мл) помещали по 0,1 г исследуемой субстанции. Спустя 24 ч (4 ч для субстанции темозоломида в среде буферного раствора pH 6,8) после начала испытания пробы незамедлительно центрифугировали.
Для темозоломида: 100 мкл надосадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 9,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 1 мл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2).
Количественный анализ полученных растворов темозоломида проводили методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре при максимуме поглощения 330 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения. Временной период проведения испытания в буферном растворе pH 6,8 был уменьшен в связи с тем, что темозоломид при значениях pH выше 5,0 достаточно быстро разлагается с образованием активного метаболита -- МТИК, имеющего максимум поглощения при длине волны 316 нм.
Для иматиниба мезилата: 100 мкл надосадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2 -- конечное для фосфатного буфера pH 6,8). 1 мл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,0 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 3 -- конечное для 0,1 M HCl и ацетатного буфера pH 4,5). Количественный анализ полученных растворов проводили методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряли при максимуме поглощения 265 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения.
Для капецитабина: 100 мкл надосадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2). Количественный анализ полученных растворов проводили методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряли при максимуме поглощения 310 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения. В среде растворения 0,1 М хлористоводородной кислоты максимум поглощения проб капецитабина составил 266 нм, что свидетельствует о разложении вещества до 5-фторурацила (в течение 24 ч при 1 400 об/мин и 37 ºС).
Результаты и обсуждение
Значения биофармацевтической растворимости субстанций рассчитывали по формуле:
S= (Di х сst х V х P)/(Dst х 100), где
Dst -- оптическая плотность стандартного раствора;
V -- разведение испытываемого раствора;
P -- содержание исследуемой субстанции в стандартном образце, %.
Статистическую обработку результатов эксперимента осуществляли с использованием пакета Microsoft Office Excel 2007 путем расчета среднего значения количества растворившейся субстанции и относительного стандартного отклонения (RSD, %).
Для каждой величины растворимости субстанции в соответствующем буферном растворе проводили расчет отношения дозы к растворимости, которое рассчитывали по формулам, рекомендованным ВОЗ и FDA:
D/S = Dmax/S, где:
D/S -- отношение дозы к растворимости, мл;
Dmax -- максимальная дозировка ЛС, зарегистрированная в РФ к медицинскому применению.
Растворимость субстанций считалась «высокой», если величина D/S принимала значение менее 250 мл.
Расчет дозового числа проводился по формуле:
Do = 250 х S, мг/мл / Dmax, мг,
где S, мг/мл -- биофармацевтическая растворимость,
Dmax, мг -- максимальная дозировка (критерий приемлемости Do ≥ 1). Полученные результаты представлены в таблице 1.
Выводы
Была определена равновесная биофармацевтическая растворимость субстанций ЛС, используемых при лечении онкологических заболеваний, методом встряхивания в термостатируемом шейкере в микрообъемах при температуре 37 ºС и скорости вращения 1 400 об/мин в течение 24 ч. По результатам исследования равновесная растворимость темозоломида и иматиниба мезилата была классифицирована как «высокая» во всех трех средах растворения, а капецитабина как «высокая» в буферных растворах с pH 4,5 и 6,8. В среде растворения 0,1 М хлористоводородной кислоты максимум поглощения проб капецитабина составил 266 нм (в отличие от 310 нм для стандартного раствора капецитабина, приготовленного в комнатных условиях), что свидетельствует о разложении вещества до 5-фторурацила в течение 24 ч при 1 400 об/мин и 37 ºС.
Источники
1. Michele G Issa, Humberto G Ferraz. Intrinsic Dissolution as a Tool for Evaluating Drug Solubility in Accordance with the Biopharmaceutics Classification System. Dissolution Technologies, 2011, 3: 6–15.
2. Draft Guidance for Industry, Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms containing certain Active Moieties. Active Ingredients based on a Biopharmaceutics Classification System, February 1999, CDER/FDA.
3. Amidon GL, Lennernas H, Shah VP, Crison JRA. A Theoretical Basis For a Biopharmaceutic Drug Classification: The Correlation of In Vitro Drug Product Dissolution and In Vivo Bioavailability. Pharmaceutical Research, 1995, 12: 413–420.
4. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. I. М.: Гриф и К., 2013.
5. Dressman J.B., Vertzoni M., Goumas K., Reppas C. Estimating drug solubility in the gastrointestinal tract. Advanced Drug Delivery Reviews, 2007, 59: 591–602.
6. Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП). Утвержден распоряжением Правительства РФ от 7 декабря 2011 г. №2199-р. М., 2011.
7. Cписок стратегически значимых лекарств. Распоряжение №1141 от 06.07.2010 «Об утверждении перечня стратегически значимых лекарственных средств, производство которых должно быть обеспечено на территории Российской Федерации для лечения наиболее распространенных заболеваний».
В работе проведено определение равновесной биофармацевтической растворимости субстанций лекарственных средств, применяемых при лечении онкологических заболеваний методом встряхивания в термостатируемом шейкере при температуре 37 ºC при скорости вращения 1 400 об/мин в течение 24 ч.
Введение
Биофармацевтическая классификационная система была разработана для того, чтобы использовать научные знания для оценки биофармацевтических свойств субстанций (активных фармацевтических ингредиентов) -- водной растворимости и кишечной проницаемости [1]. Данные о растворимости и проницаемости необходимы технологам и разработчикам для улучшения высвобождения лекарственного вещества из лекарственной формы и подбора оптимального состава вспомогательных веществ [2]. Основная цель биофармацевтической классификационной системы -- создание регуляторного орудия, которое позволяет упростить некоторые испытания биоэквивалентности тестами in vitro [3]. В настоящее время согласно Руководству по экспертизе лекарственных средств (том I) возможно предоставление данных о сравнительной кинетике растворения дженерика и препарата сравнения без исследований биоэквивалентности для дополнительных дозировок при соблюдении определенных условий [4].
Наиболее полное представление о биофармацевтических свойствах активных фармацевтических ингредиентов сокращает время и снижает затраты при разработке лекарственной формы и выводе лекарственного препарата на рынок, не снижая его качества, что особенно важно для дорогостоящих препаратов, используемых в лечении онкологических заболеваний, ВИЧ и т. д.
Растворимость лекарственного вещества, измеренная в воде, не всегда отражает растворимость в желудочно-кишечном тракте. Использование водной растворимости для предсказывания абсорбции лекарственного средства для перорального применения может привести к выраженным отклонениям в оценке биодоступности, особенно для плохо растворимых и липофильных лекарственных веществ. Механизмы, ответственные за усиление растворимости в просвете желудочно-кишечного тракта, обсуждаются [5].
Для определения растворимости ЛС равновесная растворимость оценивается в условиях, соответствующих физиологическим; другими словами, это значение должно быть определено при температуре 37 ± 1˚С в различных средах со значениями pH в диапазоне 1--7,5. Класс растворимости получается путем расчета объема раствора, необходимого для растворения максимальной дозировки во всем диапазоне pH [1]. Цель настоящего исследования -- изучить биофармацевтическую растворимость лекарственных веществ, применяемых для лечения онкологических заболеваний -- темозоломида, иматиниба и капецитабина, входящих в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП) [6]. Кроме того, данные препараты входят в список стратегически значимых лекарств [7]. Государство ставит задачу, чтобы к 2015 г. все эти ЛС производились только на территории страны.
Материалы и методы
Объекты исследования
• темозоломид, субстанция-порошок (страна-производитель -- Россия, содержание темозоломида 99,86%);
• иматиниба мезилат, субстанция-порошок (страна-производитель -- Россия, содержание иматиниба мезилата 98,97%);
• капецитабин (страна-производитель -- Россия, содержание капецитабина 99,75%).
1. Темозоломид (3,4-Дигидро-3-метил-4-оксоимидазо[5,1-d]-1,2,3,5-тетразин-8-карбоксамид)
Белый кристаллический порошок, малорастворимый в воде и растворах кислот (около 3 мг/мл).
Фармакологическое действие: противоопухолевое, алкилирующее, иммунодепрессивное. В системном кровотоке при физиологических значениях pH подвергается быстрому химическому превращению в цитотоксичный монометилтриазеноимидазолкарбоксамид (МТИК). Цитотоксическое действие МТИК обусловлено алкилированием гуанина в положении О6 и N7 (дополнительно) с последующим запуском механизма аберрантного восстановления метилового остатка. Нарушает структуру и синтез ДНК, клеточный цикл.
2. Иматиниб (4-[(4-Метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамид (и в виде мезилата))
Иматиниба мезилат -- белый или почти белый с коричневатым или желтоватым оттенком кристаллический порошок. Растворим в водных буферных растворах при pH ≤ 5,5; растворим очень незначительно или нерастворим в нейтральных/щелочных водных растворах. Растворимость в неводных растворителях варьирует от неограниченной до очень незначительной в диметилсульфоксиде, метаноле и этаноле; нерастворим в n-октаноле, ацетоне и ацетонитриле. Молекулярная масса 589,7.
Фармакологическое действие: противоопухолевое средство, ингибитор протеинтирозинкиназы (Bcr-Abl тирозинкиназы) -- аномального фермента, продуцируемого филадельфийской хромосомой при хроническом миелолейкозе.
3. Капецитабин (5'-Дезокси-5-фтор-N-[(пентилокси)карбонил]цитидин)
Белый или почти белый кристаллический порошок с растворимостью в воде 26 мг/мл при 20 °С.
Фармакологическое действие: противоопухолевое. Активируется в ткани опухоли и оказывает на нее селективное цитотоксическое действие; in vitro капецитабин цитотоксическим действием не обладает. В организме превращается в 5-фторурацил (5-ФУ), который подвергается дальнейшему метаболизму. Образование 5-ФУ из капецитабина происходит в ткани опухоли (под действием опухолевого ангиогенного фактора тимидинфосфорилазы), что сводит к минимуму системное воздействие 5-ФУ на здоровые ткани организма. Как здоровые, так и опухолевые клетки метаболизируют 5-ФУ в цитотоксически активные метаболиты: 5-фтор-2'-дезоксиуридина монофосфат (ФдУМФ) и 5-фторуридина трифосфат (ФУТФ).
Приготовление стандартных растворов
Стандартный раствор темозоломида
Около 25 мг (точная навеска) стандартного образца темозоломида помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли приблизительно 35 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8), помещали колбу в ультразвуковую ванну на 5 минут. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем тем же растворителем до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 1 темозоломида равна 0,5 мг/мл). 1 мл раствора 1 помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 40 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты pH 1,2 или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8), перемешивали, доводили объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 2 темозоломида равна 0,01 мг/мл).
Темозоломид в буферном растворе при значении pH 6,8 частично гидролизуется с образованием активного цитотоксического триазена MTIC, что проявляется внешне пожелтением раствора спустя 4 ч.
Стандартный раствор иматиниба мезилата
Около 50 мг (точная навеска) стандартного образца иматиниба мезилата вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 25 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8), доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 1 иматиниба мезилата 0,5 мг/мл). 1 мл полученного раствора вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 2 иматиниба мезилата 0,01 мг/мл).
Приготовление стандартного раствора капецитабина
Около 20 мг (точная навеска) стандартного образца капецитабина помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяли в 40 мл спирта 96%, доводили объем раствора 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или pH 6,8) до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 1 капецитабина 0,1 мг/мл). 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 8 мл растворителя с соответствующим pH, перемешивали. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем до метки тем же растворителем, перемешивали (концентрация полученного раствора 2 капецитабина 0,01 мг/мл).
Методика испытания
Определение равновесной растворимости субстанции проводили на приборе -- термошейкере в течение 24 ч при 1 400 об/мин. и 37 ºС в трех средах: буферных растворах с pH 4,5; 6,8 и 0,1 M HCl pH 1,2. Испытание проводили в трех повторностях для каждой из сред растворения. В микропробирку Eppendorf вместимостью 1,5 мл со средой растворения (объем среды растворения 1 мл) помещали по 0,1 г исследуемой субстанции. Спустя 24 ч (4 ч для субстанции темозоломида в среде буферного раствора pH 6,8) после начала испытания пробы незамедлительно центрифугировали.
Для темозоломида: 100 мкл надосадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 9,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 1 мл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2).
Количественный анализ полученных растворов темозоломида проводили методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре при максимуме поглощения 330 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения. Временной период проведения испытания в буферном растворе pH 6,8 был уменьшен в связи с тем, что темозоломид при значениях pH выше 5,0 достаточно быстро разлагается с образованием активного метаболита -- МТИК, имеющего максимум поглощения при длине волны 316 нм.
Для иматиниба мезилата: 100 мкл надосадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2 -- конечное для фосфатного буфера pH 6,8). 1 мл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,0 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 3 -- конечное для 0,1 M HCl и ацетатного буфера pH 4,5). Количественный анализ полученных растворов проводили методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряли при максимуме поглощения 265 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения.
Для капецитабина: 100 мкл надосадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2). Количественный анализ полученных растворов проводили методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряли при максимуме поглощения 310 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения. В среде растворения 0,1 М хлористоводородной кислоты максимум поглощения проб капецитабина составил 266 нм, что свидетельствует о разложении вещества до 5-фторурацила (в течение 24 ч при 1 400 об/мин и 37 ºС).
Результаты и обсуждение
Значения биофармацевтической растворимости субстанций рассчитывали по формуле:
S= (Di х сst х V х P)/(Dst х 100), где
S -- биофармацевтическая растворимость, мг/мл;
Dst -- оптическая плотность стандартного раствора;
V -- разведение испытываемого раствора;
P -- содержание исследуемой субстанции в стандартном образце, %.
Статистическую обработку результатов эксперимента осуществляли с использованием пакета Microsoft Office Excel 2007 путем расчета среднего значения количества растворившейся субстанции и относительного стандартного отклонения (RSD, %).
Для каждой величины растворимости субстанции в соответствующем буферном растворе проводили расчет отношения дозы к растворимости, которое рассчитывали по формулам, рекомендованным ВОЗ и FDA:
D/S = Dmax/S, где:
D/S -- отношение дозы к растворимости, мл;
Dmax -- максимальная дозировка ЛС, зарегистрированная в РФ к медицинскому применению.
Растворимость субстанций считалась «высокой», если величина D/S принимала значение менее 250 мл.
Расчет дозового числа проводился по формуле:
Do = 250 х S, мг/мл / Dmax, мг,
где S, мг/мл -- биофармацевтическая растворимость,
Dmax, мг -- максимальная дозировка (критерий приемлемости Do ≥ 1). Полученные результаты представлены в таблице 1.
Выводы
Была определена равновесная биофармацевтическая растворимость субстанций ЛС, используемых при лечении онкологических заболеваний, методом встряхивания в термостатируемом шейкере в микрообъемах при температуре 37 ºС и скорости вращения 1 400 об/мин в течение 24 ч. По результатам исследования равновесная растворимость темозоломида и иматиниба мезилата была классифицирована как «высокая» во всех трех средах растворения, а капецитабина как «высокая» в буферных растворах с pH 4,5 и 6,8. В среде растворения 0,1 М хлористоводородной кислоты максимум поглощения проб капецитабина составил 266 нм (в отличие от 310 нм для стандартного раствора капецитабина, приготовленного в комнатных условиях), что свидетельствует о разложении вещества до 5-фторурацила в течение 24 ч при 1 400 об/мин и 37 ºС.
Источники
1. Michele G Issa, Humberto G Ferraz. Intrinsic Dissolution as a Tool for Evaluating Drug Solubility in Accordance with the Biopharmaceutics Classification System. Dissolution Technologies, 2011, 3: 6–15.
2. Draft Guidance for Industry, Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms containing certain Active Moieties. Active Ingredients based on a Biopharmaceutics Classification System, February 1999, CDER/FDA.
3. Amidon GL, Lennernas H, Shah VP, Crison JRA. A Theoretical Basis For a Biopharmaceutic Drug Classification: The Correlation of In Vitro Drug Product Dissolution and In Vivo Bioavailability. Pharmaceutical Research, 1995, 12: 413–420.
4. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. I. М.: Гриф и К., 2013.
5. Dressman J.B., Vertzoni M., Goumas K., Reppas C. Estimating drug solubility in the gastrointestinal tract. Advanced Drug Delivery Reviews, 2007, 59: 591–602.
6. Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП). Утвержден распоряжением Правительства РФ от 7 декабря 2011 г. №2199-р. М., 2011.
7. Cписок стратегически значимых лекарств. Распоряжение №1141 от 06.07.2010 «Об утверждении перечня стратегически значимых лекарственных средств, производство которых должно быть обеспечено на территории Российской Федерации для лечения наиболее распространенных заболеваний».
