Введение
В настоящее время считается общепризнанным, что в основе многих мультифакториальных заболеваний лежит генетическая компонента. Предрасположенность к развитию целого ряда заболеваний генетически детерминирована, а сама детерминированность часто связана с системой HLA. К заболеваниям, известным как HLA-ассоциированные, относятся преимущественно аутоиммунные заболевания, инфекции, злокачественные опухоли. В настоящее время насчитывается более 40 HLA-ассоциированных заболеваний. Для части из них ассоциации с HLA-антигенами являются слабыми или случайными, для других – настолько выраженными, что нет сомнения, что один или более генов HLA-комплекса непосредственно вовлечены в патогенез заболевания [1, 2]. Большинство HLA-ассоциированных заболеваний не наследуются согласно законам Менделя по рецессивному или доминантному типу. Эти заболевания являются генетически сложными и характеризуются неполной пенетрантностью. В патогенез этих заболеваний вовлекаются как HLA-аллели, так и другие локусы, что обусловливает генетическую гетерогенность HLA-ассоциированных заболеваний. Эти заболевания являются мультифакториальными и полигенными. Ассоциации ряда заболеваний обусловлены взаимодействием не только с HLA-системой, но и со многими другими генами, а также с факторами внешней среды [3, 4]. Одним из таких HLA-ассоциированных заболеваний, вызывающих большой интерес, является глютенчувствительная целиакия (ГЦ).
ГЦ – генетически детерминированное алиментарное заболевание, для которого характерно формирование обратимой атрофической энтеропатии в ответ на токсическое действие глютена, с последующим развитием синдрома мальабсорбции и многообразными нарушениями ассимиляции пищи и обмена веществ [5–8]. В настоящее время основной гипотезой возникновения ГЦ, по мнению Всемирного общества гастроэнтерологов, является генетическая гипотеза [9-11]. Согласно этой теории глютен связывается со специфическими рецепторами энтероцитов, которые детерминированы генами системы HLA и генами, определяющими гиперчувствительность к глютену. Глютен передается на межэпителиальные лимфоциты и лимфоциты собственной пластинки СОТК. В результате такого взаимодействия образуются специфические иммунные продукты, повреждающие энтероциты ворсинок [5].
В настоящее время доказана ассоциация ГЦ с антигенами главного комплекса гистосовместимости человека HLA-DQ2 (DQA1*0501, DQB1* 0201) и HLA-DQ8 (DQA1*0301, DQB1* 0302) [5–6, 9, 12–18]. Указанные гликопротеиды расположены на поверхности макрофагов, Т и В лимфоцитов и выполняют рецепторные функции, возможно, они ответственны за распознавание «токсичных» фракций глиадина и последующего запуска комплекса иммунопатологических процессов [6, 19, 20]. Но присутствие этих аллелей недостаточно для фенотипирования болезни у всех людей. Гетеродимер DQ2 обнаруживается приблизительно у 90–95% больных целиакией, он сформирован альфа-цепочкой, кодируемой аллелями DQA1*05 и бета-цепочкой, кодируемой аллелями DQB1*0201 или DQB1*0202 [6, 21–23]. Однако аллель HLA-DQ2 является распространенным в популяции и определяется приблизительно у 30% белых европейцев без всяких признаков заболевания ГЦ [5–6, 24]. Гетеродимер DQ8, связанный с целиакией, выявляется у 5–10% больных и также сформирован альфа- и бета-цепочками, кодируемыми DQA1*03 и DQB1*0302 соответственно [6, 13, 19, 25, 23, 26–27].
Помимо вышеуказанных антигенов HLA отмечается ассоциация ГЦ с антигенами B8 и DR3 [12; 28]. Накоплено значительное количество данных о том, что в возникновении ГЦ важную роль играет не просто наличие определенных антигенов, а комбинация генов HLA I и II классов, определяющаяся при генном типировании, т.е. речь идет о конкретных гаплотипах [23, 29]. Однако суммарная роль HLA-гаплотипов в определении клинических результатов ГЦ остается до сих пор не изученной [30]. Во многих исследованиях отмечается, что именно комбинация антигенов дает более сильную ассоциацию с ГЦ [31]. Отмечается, что для ГЦ характерно наличие гаплотипов HLA-A1-B8-DR3 и HLA-B44-DR7.
В настоящее время наблюдается повышенный интерес врачей-гастроэнтерологов всего мира к ГЦ, возрастает потребность в дополнительных методах диагностики данного заболевания [32]. В связи с этим возрастает интерес к разработке и использованию скрининговых программ для ранней диагностики ГЦ и выявления групп риска среди родственников пациентов с подтвержденным диагнозом. Выявление иммуногенетических маркеров ГЦ является в настоящее время крайне актуальной проблемой. Широкое внедрение в медицинскую практику новых молекулярно-генетических диагностических методов исследования определяет необходимость их использования в качестве дополнительных методик диагностики ГЦ.
Целью данного исследования явилось определение генетической предрасположенности к развитию ГЦ и риска возникновения заболевания с учетом иммуногенетических характеристик у детей в г. Москве, а также наличие связи с клиническими формами заболевания.
Материалы и методы исследования
В исследование было включено 2 группы:
- основная группа (группа больных) – 28 детей в возрасте от 1 года до 17 лет (средний возраст – 7,53+4,9) с установленным диагнозом ГЦ, состоящих на учете в Научном центре здоровья детей РАМН;
- контрольная группа - 1700 образцов пуповинной крови новорожденных, условно здоровых детей, родившихся на 37–41 неделе гестации в г. Москве за период с 2004 по 2009 г.
Геномную ДНК выделяли из свежих или замороженных образцов периферической крови методом сепарации на магнитных частицах с использованием сертифицированных коммерческих наборов BioSprint 15 DNA Blood kit фирмы Qiagen (США). HLA-типирование проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двух методов молекулярного генетического типирования: генотипирование методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов (SSO) и генотипирование методом ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров (SSP). Молекулярное типирование проводили на уровне групп аллелей (специфичностей). Основным методом для выявления HLA-специфичностей, характерных для больных ГЦ, был метод SSO. Для проведения амплификации готовили рабочую смесь следующего состава: 7,5 мкл 0,6мМ MgCl2; 15 мкл Мastermix (включающий 30% глицерол, 100мМ KCl, нуклеотиды, биотинилированные праймеры и 100 ед/мл Taq polymerase); 7,5 мкл ДНК (концентр. 13–15 нг/мкл). Режим амплификации представлен в таблице 1. Общая продолжительность амплификации составляла 1,5 часа. Искомые специфичности улавливались с помощью метода блот-гибридизации, представляющего собой процесс конъюгации специфических участков ДНК с олигонуклеотидными зондами (Sequence Specific Oligonucleotides), фиксированными на специальных полосках-стрипах. Конъюгированные фрагменты окрашивались пероксидазой (Invitrogen, USA). Полученные результаты со стрипа считывались с помощью сканера AutoCam. Интерпретацию результатов проводили в автоматическом режиме с помощью программы Dynal PMP.
Метод SSP (Sequence Specific Primer), основанный на улавливании в процессе амплификации искомых участков ДНК аллель-специфическими праймерами, использовался для исключения двойных интерпретаций и выявления специфических аллелей DQB1*.
Были протипированы все HLA-локусы I класса: А*, В*, Cw* и II класса: DRB1* и DQB1* среди здоровых доноров московской популяции и взрослых пациентов с установленным диагнозом ГЦ. Для изучения генетической предрасположенности к ГЦ был проведен сравнительный анализ как отдельных аллельных вариантов всех генов HLA, так и их межлокусных сочетаний в генотипе больных и в контрольной группе.
Статистический анализ исследования ассоциаций проводился с использованием современных компьютерных программ.
Результаты исследования и их обсуждение
На рисунке 1 представлены данные частоты встречаемости специфичностей, выявленных как статистически значимые положительные ассоциации с ГЦ при сравнении основной и контрольной групп. Установлено, что у детей с ГЦ встречались специфичности: HLA-B*08 – в 3 раза; HLA-B*41 – в 2,8 раза; HLA-B*50 – в 3,7 раза; HLA-Cw*17 – в 2,9 раза; HLA-DRB1*03 – в 3,3 раза; HLA-DRB1*07 – в 1,7 раза и HLA-DQB1*02 в 2 раза чаще, чем в контрольной группе. Достоверного отличия, позволяющего исключить «нулевую гипотезу» по специфичности HLA-DQB1*03, некоторые аллели которой экспрессируют гетеродимер DQ8, ассоциированный с ГЦ, выявлено не было.
По частоте встречаемости других специфичностей всех исследуемых локусов основная и контрольная группы не различались.
Помимо групп аллелей (специфичностей), выявленных как положительные статистически значимые ассоциации с ГЦ, были выявлены статистически значимые отрицательные ассоциации с ГЦ по группе аллелей HLA-DRB1*15 (основная группа – 3,57% (f=0,0357); контрольная группа – 13,21% (f=0,13), р=0,013) и группе аллелей HLA-DQB1*06 (основная группа – 7,14% (f=0,0714); контрольная группа – 22,24% (f=0,2224), р=0,002).
Для дальнейшего анализа связи выявленных статистически значимых групп аллелей (специфичностей) с ГЦ был произведен подсчет показателей RR (относительный риск развития заболевания), OR (отношение шансов возникновения заболевания), EF (этиологическая фракция), PF (превентивная фракция). Для всех величин вычислялся доверительный интервал, р<0,05.
Из таблицы 2 видно, что высокие значения показателей относительного риска развития заболевания, отношение шансов, этиологическая фракция для групп аллелей (специфичностей) с положительной ассоциацией в группе больных отмечены для всех специфичностей, выявленных у пациентов, как положительные статистически значимые ассоциации с ГЦ. Для специфичностей HLA-В*08, HLA-DRB1*03 и HLA-DQB1*02 эти показатели превышают единицу, достоверны (р<0,05) и их доверительные интервалы не проходят через единицу. Этот факт достоверно свидетельствует о значительной выраженности ассоциации данных специфичностей с ГЦ. Несмотря на то что показатели OR, RR и EF для специфичностей HLA-В*41, HLA-В*50 и HLA-Cw*17 превышают единицу, доверительные интервалы величин этиологической фракции проходят через единицу и начинаются с отрицательных чисел, что не позволяет рассматривать данные специфичности как ассоциированные с ГЦ.
При сравнении частот встречаемости специфичностей не было выявлено достоверного отличия между основной и контрольной группами по специфичности DQB1*03. Однако в связи с данными о протективном значении антигена HLA DQ8 был произведен подсчет показателей относительного риска, отношения шансов и этиологической фракции для этой специфичности. Из таблицы 2 видно, что при значениях данных показателей >1 доверительные интервалы всех параметров проходят через 1. Это указывает на низкую ассоциацию группы аллелей (специфичности) HLA-DQB1*03 с ГЦ. Возможно, данные результаты связаны с немногочисленностью группы пациентов. Этот факт, несомненно, требует дальнейшего изучения.
Таким образом, проведенное исследование позволяет предполагать существование генетически детерминированной связи развития заболевания с выявленными статистически значимыми специфичностями.
В таблице 3 представлены величины рисков и превентивной фракции для специфичностей, выявленных как статистически значимые отрицательные ассоциации в основной группе. Как видно из представленной таблицы, значения относительного риска и отношения шансов были меньше единицы. Доверительные интервалы <1, р<0,05. В данной ситуации ассоциацию с ГЦ можно считать отрицательной. Величины превентивной фракции, напротив, были достаточно высоки. Однако доверительный интервал превентивной фракции специфичности HLA-DRB1*15 имеет отрицательные значения и проходит через единицу. Следовательно, достоверно значимой можно считать только специфичность HLA-DQB1*06. Такое сочетание низких показателей относительного риска и отношения шансов с высокими показателями превентивной фракции позволяет говорить об устойчивости к развитию ГЦ при наличии данной специфичности.
При исследовании HLА-генотипов основной группы и группы сравнения было обнаружено, что некоторые специфичности, определяющиеся как статистически значимые положительные ассоциации, встречаются в определенных сочетаниях. Необходимо отметить, что при отсутствии информации о генотипах родителей пациентов обеих экспериментальных групп и родителях здоровых испытуемых контрольной группы утверждать, что данные сочетания – гаплотипы, не представляется возможным. Исходя из этого статистическую обработку проводили без анализа величины неравновесного сцепления. Был произведен подсчет частот встречаемости подобных сочетаний, а также величин относительного риска и отношения шансов возникновения ГЦ при выявлении в генотипе следующих совместно встречающихся специфичностей:
Первая комбинация – HLA-В*08; HLA-DRB1*03; HLA-DQB1*02.
Вторая комбинация – HLA-DRB1*07; HLA-DQB1*02/HLA-DQB1*03.
Как видно из рисунка 2, первая комбинация совместно встречающихся специфичностей выявлялась у детей с ГЦ в 4,6 раза чаще, чем в контрольной группе. Вторая комбинация – в 3,6 раза чаще, чем в контрольной группе. Следует отметить, что для обеих комбинаций специфичностей, как видно из таблицы 4, выявлены значения относительного риска и отношения шансов развития заболевания, значительно превышающие единицу. Доверительные интервалы не проходят через 1. Значения этиологической фракции велико в обоих случаях. Полученные данные достоверны (р<0,05) и позволяют предполагать связь между наличием в генотипе одного или обоих вариантов совместно встречающихся специфичностей и развитием ГЦ.
Для анализа клинических проявлений ГЦ в основной группе все пациенты этой группы были разделены на 3 подгруппы.
- В первую подгруппу входили пациенты основной группы, в генотипе которых был выявлен первый вариант совместно встречающихся специфичностей - HLA-В*08; HLA-DRB1*03; HLA-DQB1*02.
- Во вторую – пациенты основной группы с вторым сочетанием совместно встречающихся специфичностей - HLA-DRB1*07; HLA-DQB1*02/HLA-DQB1*03.
- И в третью – дети, в генотипе которых были выявлены другие сочетания специфичностей, определяющиеся как статистически значимые положительные ассоциации, какая-либо одна из значимых специфичностей или не выявлено специфичностей, имеющих положительную ассоциацию с заболеванием.
При анализе специфичностей в третьей подгруппе у 7 (25%) детей были выявлены только специфичности DQB1*03, трое из них имели аллель, не экспрессирующую серологически выявленную молекулу DQ8, т.е. не имели генетических маркеров ГЦ. Это подтверждает гипотезу, что мультифакториальные заболевания следует рассматривать как зависимые, а не сцепленные с генетическим фактором.
В результате анализа клинических проявлений ГЦ в основной группе не было выявлено статистической разницы между клиническими формами в зависимости от варианта совместно встречающихся HLA-специфичностей в генотипе пациентов.
Заключение
В результате проведенного исследования в группе детей с ГЦ выявлены положительные ассоциации данного заболевания с HLA-специфичностями: HLA-B*08, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*07, HLA-DQB1*02. Помимо отдельных специфичностей генетическими факторами предрасположенности к ГЦ являются сочетания специфичностей в генотипе пациентов (HLA-В*08; HLA-DRB1*03; HLA-DQB1*02 и HLA-DRB1*07; HLA-DQB1*02/HLA-DQB1*03), каждое из которых является самостоятельным генетическим маркером ГЦ. Данные специфичности и их сочетания в генотипах являются общими для детей и взрослых пациентов с ГЦ. Выявлена отрицательная ассоциация с ГЦ по группе аллелей HLA-DQB1*06.
Выявление у новорожденных детей специфических маркеров системы HLA молекулярным методом ПЦР рекомендуется учитывать как фактор риска развития заболевания и для генетического прогнозирования в семьях больных ГЦ. Такие дети являются группой повышенного риска и нуждаются в наблюдении.
Полученные молекулярным методом ПЦР данные распределения генов HLA-системы у пациентов с ГЦ, характерные для московской популяции, рекомендуется использовать для проведения подобных исследований в медицинских учреждениях аналогичного профиля других регионов России для выявления групп риска и создания регистра больных ГЦ. Полученные результаты имеют прогностическое значение, позволяют выявлять индивидуальный риск развития заболевания и проводить генетическое прогнозирование среди здорового населения и в семьях больных ГЦ.
Литература
1. Thorsby E. Invited Anniversary Review: HLA Associated Diseases. Human Immunol 1997; 53: 1–11.
2. Thoson G. HLA Disease Associations: Models for the Study of Complex Human Genetic Disorders. Crit Rev Clin Lab Sci 1995; 32(2): 183–219.
3. Система HLA и патология человека. Под редакцией А.А.Баранова, Б.С.Каганова, С.А.Шер, А.Е.Богорад. М.: Изд. Дом «Династия» 2003:10–25, 73–87.
4. Larsen C.E., Alper C.A. The genetics of HLA – associated disease. Curr Opin Immunol 2004; 16(5): 660–667.
5. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Лысиков Ю.А. и др. Клинические аспекты целиакии у детей: пособие для практикующих врачей-педиатров. М.: МедЭкспертПресс 2007; 79: 8–25, 45–47.
6. Парфенов А.И. Целиакия. Эволюция представлений о распространенности, клинических проявлениях и значимости этиотропной терапии. М.: Анахарсис 2007; 376: 14–50, 126–148.
7. Murray J.A., Rubio-Tapia A., Van Dyke C. et al. Mucosal atrophy in celiac disease: extent of involvement, correlation with clinical presentation, and response to treatment. Clin Gastroenterol Hepatol 2008; 6: 186–193.
8. Richard J. Farrell, M.D., Ciaran P. Kelly, M.D. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 2002; 346 (3): 180–188.
9. Вохмянина Н.В. Генетические маркеры целиакии. Материалы 10-го Славяно-Балтийского научного форума. Ж. «Гастроэнтерология Санкт-Петербурга» 2008; 2–3: М23.
10. Anderson O.D., Hsia C.C., Adalsteins A.E., Lew E. J.-L. and Kasarda D.D. Identification of several new classes of low-molecular-weight wheat gliadin-related proteins and genes. Theor Appl Genet 2001;103: 307–315.
11. Liu E. Genetic testing for celiac disease. MLO Med. Lab. Obs 2006; 38: 10–13.
12. Болдырева М.Н. HLA (класс II) и естественный отбор. «Функциональный» генотип, гипотеза преимущества «функциональной» гетерозиготности. Автореф. Дисс…д.м.н., М., 2007.
13. Bergseng E., Xia J., Kim C.Y., Khosla C., Sollid L.M. Main chain hydrogen bond interactions in the binding of proline-rich gluten peptides to the Celiac disease-associated HLA-DQ2 molecule. J Biol Chem 2005; 280: 21791–21796.
14. Green P.H., Cellier C. Celiac disease. N Engl J Med 2007; 357: 1731–1743.
15. Karinen H., Karkkalnen P., Pihlajamaki J. et al. Gene dose effect of the DQB1*0201 allele contributes to severity of celiac disease. Scand J Gastroenterol 2006; 41: 19–199.
16. Megiorni F., Mora B., Bonamico M. et al. HLA-DQ and susceptibility to celiac disease: evidence for gender differences and parent-of-origin effects. Am J Gastroenterol. 2008; 103: 997–1003.
17. Setty M., Hormaza L., Guandalini S. Celiac disease: Risk assessment, diagnosis, and monitoring. Mol Diagn Ther 2008; 12(5): 289–298.
18. Zubillaga P., Vidales M.C., Zubillaga I. et al. HLA-DQA1 and HLA-DQB1 genetic markers and clinical presentation in celiac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2002; 34: 548–554.
19. Agostoni C., Breagger C., Decsi T. et al. A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2009; 49(1б July 2009): 112–125.
20. Arentz-Hansen H., McAdam S.N., Molberg, et al. Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadins rich in proline residues. Gastroent 2002; 123:803–809.
21. Kati K. Dissecting genetic susceptibility to gluten sensitivity: HLA-linked risk factors in coeliac disease and dermatitis herpetiformis. Academic dissertation. Helsinki 2003; 28–29.
22. Kim C.Y., Quarsten H., Bergseng E. et al. Structural basis for HLA-DQ2-mediated presentation of gluten epitopes in celiac disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 4175–4179.
23. Louka A.S., Sollid L.M. HLA in celiac disease: unraveling the complex genetics of a complex disorder. Tissue Antigens 2003; 61:105–117.
24. Sollid L.M. Institute of Immunology, Rikshospitalet, University of Oslo, N-0027 Oslo, Norway Molecular Basis of Celiac Disease. Annual Reviev of Immunology 2000; 18: 53–81.
25. Johnson T.C., Diamond B., Memeo L. et al. Relationship of HLA-DQ8 and severity of celiac disease: comparison of New York and Parisian cohorts. Clin Gasyroenterol Hepatol 2004; 2 (10): 888–894.
26. Lundin K.E., Scott H., Fausa O. et al. T cells from the small intestinal mucosa of a DR4, DQ7/DR4, DQ8 celiac disease patient preferentially recognize gliadin when presented by DQ8. Hum Immunol1994; 41: 285–291.
27. Mazarella G., Maglio M., Paparo F. et al. An immunodomunant DQ8 restricted gliadin peptide activates small intestinal immune response in in vitro cultured mucosa from HLA-DQ8 positive but not HLA-DQ8 negative celiac patients. Gut 2003; 52: 57–62.
28. Зарецкая Ю.М., Леднев Ю.А. HLA 50 лет: 1958–2008. Тверь: ООО, «Издательство «Триада» 2008: 24–53.
29. Jill M. Norris, Katherine Barriga, Edward J. Hoffenberg, et al. Risk of Celiac disease autoimmunity and timing of gluten introduction in the diet of infants at increased risk of disease. JAMA. 2005; 293 (19): 2343–2351.
30. Distefano R., Bonomo L., Travali S., Scrofani E., Bonomo P. Prevalence of HLA haplotipes related to Celiac Desiase in the province of Ragusa (Sicili). Tissue Antigens 2010; 75: 608.
31. Lopez-Vazquez A., Fuentes D., Rodrigo L. et al. MHC class I region plays a role in the development of diverse clinical forms of celiac disease in a Saharawi population. Am J Gastroenterol. 2004; 99(4): 662–667.
32. Rashtak S., Murray J.A. Tailored testing for celiac disease. Ann Intern Med. 2007;147(5):339–341.
Таблицы, рисунки - в приложении
