Г.Н. ГИЛЬДЕЕВА, к.б.н., доцент кафедры организации и управления в сфере обращения лекарственных средств ГБОУВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
В статье рассмотрены принципы и основы альтернативной in vitro-токсикологии. Обсуждаются преимущества и недостатки токсикологических тест-систем in vivo и in vitro. Изложена современная парадигма токсикологических исследований in vitro, стратегия их осуществления, а также кратко описаны некоторые альтернативные методические подходы, использующиеся в доклинических исследованиях.
Проблемы этического, разумного и экономного использования лабораторных животных в современных доклинических исследованиях лекарственных препаратов привлекают большое внимание специалистов и общественности. Безусловно, эксперименты на животных крайне важны для сохранения здоровья человека, однако эти исследования являются трудоемкими и дорогостоящими, а также они травмируют подопытных животных и приводят к их гибели. Поэтому сегодня вполне обоснованы усилия ученых, направленные на максимальное сокращение количества животных и замену их альтернативными моделями и тест-системами в условиях in vitro. Современные методы позволяют не только свести количество подопытных животных к минимуму, но и полностью или частично заменить их. Такие методы помогают помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых лекарственных препаратов, прежде всего на стадии их доклинических исследований [1, 5].
В настоящее время все большее внимание уделяется концепции усовершенствования, уменьшения и замены (Refinement, Reduction, and Replacement), которая также известна как «Три R», а методы, использующие эту концепцию, называются альтернативными [6, 14]. В данной концепции Refinement (усовершенствование) включает методы, исключающие или вызывающие минимальную боль, страдания и стресс у животных. Reduction (сокращение) включает методические подходы, позволяющие получать информацию при использовании меньшего числа животных или получения большего количества данных на том же количестве животных. Replacement (замена) означает замену на методы, позволяющие достичь цели без проведения экспериментов на животных. За последние 50 лет концепция «трех R» получила выражение в законах, стандартах и руководящих документах во всем мире. Сегодня концепция «трех R» является самой передовой в области научных исследований. Благодаря этой концепции удалось сконцентрировать на данной проблеме внимание правительств и академических центров, что привело к существенному изменению техники исследований, испытаний и обучения с пользой как для науки, так и в интересах защиты экспериментальных животных [2].
Всемирная организация здравоохранения, международное медико-биологическое общество не только одобряют, но и настоятельно рекомендуют и поддерживают использование альтернативных моделей и методов в токсикологии. Использование in vitro-тестов при оценке безопасности, разработке лекарств и новых продуктов уже стало общепринятым. Согласно принципам правительства США по использованию животных в научных исследованиях, тестировании и образовании и политике Министерства здравоохранения США по гуманному обращению и использованию лабораторных животных, до проведения тестирования на животных должны использоваться in vitro тест-методы определения базальной цитотоксичности, где это приемлемо [12]. Такие методы считаются частью взвешенного подхода для оценки начальной дозы при исследовании острой пероральной токсичности препаратов in vivo. Для некоторых исследуемых препаратов подобный подход уменьшает число используемых животных, а также долю животных, которые погибают или умерщвляются в процессе эксперимента. Многие крупные международные компании уже широко используют альтернативные методы.
В 2007 г. Национальный научный совет США (NRC) опубликовал доклад о будущем токсикологических исследований, в котором говорится, что настало время разработки новой парадигмы, не основанной на использовании животных. Основное предложение доклада заключалось в переориентации тестирования на молекулярный уровень вместо наблюдения фенотипических реакций целого организма, переходе от тестирования на целом животном на тестирование на клеточном уровне [9].
У таких предложений есть серьезные основания, поскольку несовершенство и ограничения тестирования на животных очевидны и понятны. Традиционная токсикология in vivо трудоемка, она требует много времени и расхода большого количества тестируемого продукта. Тестирование на животных трудно адаптировать к современному направлению высокопроизводительных скрининговых технологий, что в конечном счете создает препятствия на пути массового скрининга лекарственных препаратов и химических веществ.
Использование новейших научных инструментов для доказательства безопасности и эффективности новых продуктов в кратчайшие сроки, с большей надежностью и меньшими расходами является насущной необходимостью. Клетки in vitro являются средством, обеспечивающим дальнейшее развитие в этом направлении. В настоящее время возможно культивировать широкий спектр клеток различных типов, в т. ч. из разных тканей и видов. Это очень удобно, т. к. создаются условия для определения орган- и видоспецифичной токсичности. Если же используются клетки человека, то минимизируются проблемы межвидовой экстраполяции [13]. Другими словами, преимущества тестов in vitro заключаются в том, что они быстры, недороги и позволяют исследовать специфические механизмы действия исследуемых агентов.
Еще одно преимущество моделей in vitro заключается в возможности работы непосредственно на культурах клеток человека, что делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные синергические и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений.
Крупный вклад в развитие нового направления -- клеточной токсикологии внес выдающийся шведский ученый Бъерн Икволл (Bjorn Ekwall). Сформулированная им в 1983 г. концепция т. н. базовой цитотоксичности лежит в основе использования тестов на культуре клеток для определения острой токсичности химических веществ вместо тестов на животных. Чтобы на практике проверить свои теории, был организован международный токсикологический проект под названием Multicentre Evaluation of In Vitro Cytotoxicity Programm (MEIC), в котором 50 отобранных химических веществ тестировались в 100 лабораториях во всем мире, причем было применено более 60 различных тестов in vitro. Результаты проекта MEIC наглядно продемонстрировали возможность использования тестов in vitro для прогнозирования токсических концентраций химических веществ в организме человека [7].
В ходе работы над этим проектом было выделено 3 типа токсичности:
• Базовая (общая) цитотоксичность -- неблагоприятное воздействие химических веществ на общие для всех клеток структуру и функции, необходимые для выживания клетки, деления, репликации ДНК и т. д.
• Органоспецифическая цитотоксичность -- влияние на структуры и функции, специфические для определенных клеток тканей и органов.
• Внеклеточная токсичность -- проявляется, если ксенобиотик непосредственно не влияет на клетку, но его действие критическое на уровне целостного организма и охватывает процессы, происходящие вне клеток (например, клеточная секреция).
Автор указывал, что все три типа цитотоксичности могут иметь место in vivo, поэтому должны учитываться в стратегии исследований in vitro [8].
Исследования токсичности лекарственных препаратов in vitro проводят на первичных культурах клеток и тканей, выделенных из организма животных, человека, а также перевиваемых или постоянных, полученных из отдельных видов опухолей. К первичным культурам клеток человека относятся гепатоциты, эпителиоциты, кератиноциты, хондроциты. Первичные культуры клеток животных представлены гепатоцитами, клетками крови. Также для оценки токсичности используют постоянные клеточные линии человека: клетки немелкоклеточного рака легких -- А-549, нейробластомы NB-1, эпителиальные клетки синовиальной жидкости -- McCoy и др. Среди постоянных клеточных линий животных в токсикологических исследованиях используют: фибробласты мышей -- L929, BALB 3T3; клетки гепатомы крыс -- HTC; клетки опухоли Эрлиха мышей и др. Из специализированных клеток можно выделить эритроциты периферической крови мышей BALB/c, сперматозоиды быка, мышечные клетки крысы. Исследование на различных клеточных линиях предоставляет четкую информацию о потенциальных эффектах лекарственных препаратов и их специфическом действии [11].
В настоящее время исследования общей и специфической токсичности потенциальных тератогенов наиболее эффективно проводятся с применением полипотентных стволовых клеток эмбрионов человека, которые способны к дифференциации in vitro с образованием миокардиальных, мышечных, эндотелиальных клеток, гепатоцитов [3].
При оценке тканевой токсичности используют срезы тканей и реконструированные модели, которые имитируют нормальные ткани in vitro [3]. Такие модели позволяют проводить такие испытания, как исследование раздражающего действия лекарственных препаратов, исследование фототоксичности, исследование абсорбции вещества через кожу и ее барьерной функции и др. На сегодня известны коммерческие органотипичные и реконструированные модели эпидермиса, такие как EPISKIN, EpiDerm, Full Thickness. На указанных моделях были выполнены опыты с изучением повреждающего действия большого количества химических веществ. Эти модели стандартизированы, зарегистрированы и внесены Европейской организацией экономического сотрудничества и развития (OECD) в лист инструкций по тестированию токсичности химических веществ, а также в новое Европейское законодательство REACH [4].
Одним из самых сложных направлений в создании альтернативных моделей изучения токсичности является разработка моделей барьерных систем организма [10]. В этом направлении наиболее весомые успехи достигнуты в воспроизведении эпителиального барьера, который является первым препятствием на пути проникновения ксенобиотика в организм. Для исследований интерстициального барьера наибольшее развитие получили модели процессов абсорбции с использованием клеточных линий НТ-29 и Сасо-2. Относительно гематоэнцефалического барьера, что является важным для многих токсичных веществ, то в этом направлении разрабатываются трехмерные модели, содержащие глиальные и эндотелиальные клетки. Были созданы органотипичные модели: модель глаза для изучения раздражающего действия в замену теста Драйзера на кроликах [15]. Система клеточных культур, аналогичная головному мозгу, разработана для тестирования нейротоксичности [3]. Проведенные исследования показали, что реконструированные модели, имитирующие нормальные ткани in vitro, имеют хорошую корреляцию с системным токсическим действием, определяемым у животных.
Таким образом, исследования с использованием клеточных культур позволяют проводить сравнительную экспресс-оценку токсичности и опасности химического вещества, исследование нарушения обмена веществ в клетке, изучение цито- и органотоксичности, мутагенных и канцерогенных эффектов. Для исследования цитотоксичности ксенобиотиков на культуре клеток рекомендованы следующие тесты: 1) определение количества жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего; 2) определение содержания общего белка как показателя прироста клеточной массы, который также может быть показателем клеточной пролиферации; 3) определение изменений активности дыхательных ферментов в тесте с метилтетразолием (МТТ); 4) оценка лизосомальной активности и интенсивности процессов активного мембранного переноса -- по поглощению красителя нейтрального красного; 5) оценка степени повреждения цитоплазматической мембраны -- по выходу в среду инкубации фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Кроме вышеперечисленных методов, довольно часто применяются такие тесты, как определение нарушения регуляции ионного состава, оценка нарушения процессов метаболизма, определение содержания аденозинтрифосфата (АТФ) в клетках и инкубационной среде, оценка морфологических изменений клеток.
Для изучения органотоксичности используют тесты, что и при определении общей токсичности, а также специфические маркеры: ферменты аланинаминотрансфераза (АЛТ) и аспартатаминотрансфераза (АСТ) -- для клеток печени; ЛДГ и тропонин -- для клеток сердечной ткани; для фибробластов кожи -- скорость синтеза коллагена; для иммунотоксичности -- синтез интерлейкинов и антител, уровень С-реактивного белка. Кроме того, для всех типов клеток можно провести ПЦР (полимеразная цепная реакция) диагностику с целью определения активации того или иного гена, отвечающего за синтез белка, фермента, кофактора. По результатам вышеуказанных тестов определяют такие параметры, как IC50 (концентрация, подавляющая рост 50% клеток в культуре), LC50 (концентрация вещества, вызывающая гибель 50% клеток), EC50 (концентрация, вызывающая снижение функции у 50% клеток).
На сегодня уже имеются определенные достижения использования культуры клеток при изучении хронической токсичности in vitro. При этом продолжительность экспозиции исследуемого вещества как минимум длится пять суток. Инкубация с препаратом может быть как непрерывной, так и в виде нескольких повторных его введений в культуральную среду.
Сравнивая опыты, которые проводят на животных и эксперименты на культуре клеток в условиях in vitro, можно выделить ряд преимуществ. Во-первых, тесты на культуре клеток можно проводить в микроколичествах. Дозу исследуемого вещества, получаемого каждой клеткой, можно измерять и контролировать с достаточно высокой точностью, что облегчает установку токсической концентрации ксенобиотика. Во-вторых, исследования на культуре клеток дают результаты, позволяющие проводить количественную оценку, изучать зависимости «доза -- эффект» и «структура -- активность». В-третьих, преимуществом метода культуры клеток является высокая технологичность процесса исследований и автоматизация значительной их части, возможность проведения скрининга одновременно нескольких веществ и непосредственно на клетках органов человека [8].
Проблема внедрения альтернативных методов изучения токсичности и безопасности различных химических веществ, в т. ч. лекарственных препаратов, в систему доклинических исследований остается актуальной, но вместе с тем еще далеко незавершенной. В ближайшем будущем предстоит включить знания о механизмах, полученные в ходе клеточных и молекулярных исследований, в обширный арсенал данных in vivo, с тем чтобы более подробно описать токсикологические механизмы, а также создать парадигму использования данных in vitro для прогноза токсичности in vivo. Ценность методов in vitro является общепризнанным фактом, однако их повсеместное внедрение может быть реализовано только в результате совместных усилий токсикологов и представителей государственных учреждений.
ИСТОЧНИКИ
Гуськова Т.А., Сюбаев Р.Д., Немкова И.Н., Енгалычева Г.Н. Изучение токсичности лекарственных средств in vitro при оценке их токсикологического взаимодействия. Биомедицина. 2010. 5. 74-76.
1. Коршун М.Н., Краснокутская Л.М. Принцип Трех R и пути его реализации в токсиколого-гигиенических исследованиях. Український журнал з проблем медицини праці. 2005. 3–4. 66–74.
2. Трахтенберг І.М., Коваленко В.М., Кокшарьова Н.В., Жмінько П.Г. та ін. Альтернативні методи і тест-системи. Лікарська токсикологія. К.: Авіцена, 2008. 272 с.
3. Afaller W, Balls M, Clotier R et al. European Commision-Enterprise and Industry-REACH – Overview-FAG. Novel advanced in vitro methods for long-term toxicity testing. ATLA. 2001. 29, 4. 393–426.
4. Arturo Anadón et. al. The role of in vitro methods as alternatives to animals in toxicity testing. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, January 2014, 10, 1 : 67-79.
5. Balls M, Reader S, Atkinson K et al. Non-animal toxicity tests for detergents: genuine replacements or mere prescreens. J. Chem. Biotechnol. 1991. 50. 423-433.
6. Ekwall B. Correlation between cytotoxicity in vitro and LD50 values. Acta Pharmacologies Toxicologica. 1983. 52, S. II. 80–99.
7. Ekwall B, Clemedson C, Ekwall B et al. EDIT: a new international multicentre programme to develop and evaluate batteries of in vitro tests for acute and chronic systemic toxicity. ATLA. 1999. 27. 339–349.
8. Grossblatt N, Karalic-Loncarevic M, editors. Toxicity Testing in the 21th Century: A vision and a Strategy. Washington: National Academy Press. 2007. 196.
9. Guth K et al. Suitability of skin integrity tests for dermal absorption studies in vitro. Toxicol In Vitro. 2015 Feb, 29(1): 113-23.
10. Holme JA, Dybing E. The use of n vitro methods for hazard characterisation of chemicals. J.A.Holme, E.Dybing. Toxicology Letter. 2002. 127, 1–3. 136–141.
11. Interagency Research Animal Committee (US). U.S. Government Principles for Utilization and Care of Vertebrate Animals Used in Testing, Research, and Training. Fed. Regist. 1985, 50 (97): ISO 10993.
12. Marx U, Sanding V, editors. Drug Testing In Vitro: Breakthroughts and Trends in Cell Culture Technonogy. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007. 298.
13. Schuppli CA, Fraser D. The interpretation and application of the three Rs by animal ethics committee members.-ATLA. 2005. 33, 5. 487–500.
14. Verstraelen S et al. Improvement of the Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) assay as an in vitroalternative to the Draize rabbit eye irritation test. Toxicol In Vitro. 2013 Jun, 27(4): 1298-311.
Источник: Вестник Росздравнадзора, № 5, 2015
